作者：魏为 唐罗生 李立 杨一涛 王文军
作者单位：（410011）中国湖南省长沙市，中南大学湘雅二医院眼科
【摘要】目的：观察榄香烯乳联合足叶乙甙对视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞凋亡及survivin表达的影响及其作用机制。
方法：采用榄香烯乳、足叶乙甙单药及两者联合处理视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞，观察HXO-RB44细胞生长情况并采用四甲基偶氮唑蓝（MT）
结果：HXO-RB44细胞经榄香烯乳、足叶乙甙及两者联合处理后，细胞增殖受到不同程度的抑制(r =0.963，P ＜0.05)，survivin蛋白表达下降(P ＜0.01)；其中以两者联合用药最为显著。
结论：榄香烯乳联合足叶乙甙能协同抑制HXO-RB44细胞的增殖，并可能下调survivin的表达，促进细胞的凋亡，抑制RB细胞系增生。
【关键词】 榄香烯乳 足叶乙甙 视网膜母细胞瘤 survivin 凋亡
Effect of elemene and/or etoposide on the expression of survivin and apoptosis of retinoblastoma HXO-RB44 cells
Wei Wei, Luo-Sheng Tang, Li Li, Yi-Tao Yang, Wen-Jun Wang
Department of Ophthalmology, Xiangya Second Hospital, Central-South University, Changsha 410011, Hunan Province, China
AbstractAIM: To investigate the effects of elemene and/or etoposide on the apoptosis of human retinoblastoma HRO-RB44 cell and the expression of survivin in vitro. METHODS: The HRO-RB44 cells were treated with elemene and/or etoposide for 24 hours, and then the proliferation was assessed by MTT method. The survivin expression were analyzed by flow cytometry and RT-PCR. RESULTS: Elemene and etoposide could inhibit the growth of HXO-RB44 cells, down-regulate the expression of survivin, and induce extensive apoptosis of HRO-RB44 cell. CONCLUSION: Elemene could enhance the effects of etoposide on proliferative suppression, survivin expression down-regulation, and apoptosis induction of HRO-RB44 cells.
· KEYWORDS: elemene; etoposide; retinoblastoma; survivin; apoptosis
0引言
视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）是婴幼儿最常见的恶性肿瘤之一，严重危害患者的视功能并危及生命。目前化学药物治疗在视网膜母细胞瘤眼内期病例的保守治疗，眼外期病例的辅助治疗，晚期病例的姑息治疗等方案中起到非常重要的作用[1-3]。近年来由于治疗方法的进步，RB眼球摘除率明显下降，保守治疗的机会增加，寻求有效的药物治疗仍是我们努力的方向。足叶乙甙（etoposide,VP-16）是新一代化疗药物，具有广谱的抗肿瘤活性，但全身大剂量的VP-16化疗能引起肝肾功能损害及骨髓抑制作用，甚至因全身大剂量化疗容易引起继发性恶性肿瘤的发生，最近Lee等[4]曾报道应用VP-16治疗后继发急性粒细胞性白血病。因此，探索低剂量多药联合应用，是肿瘤药物研究的一个重要方向[5]。榄香烯乳是从活血化瘀中药温莪术挥发油中提取的油状物单体，属于不含氮的倍半烯烃类，为国家二类抗癌新药。实验药理学及临床药理学都证实该制剂对多种肿瘤细胞有确切疗效[6]。我们采用榄香烯乳联合VP-16作用于视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞，观察两者对HXO-RB44细胞增殖、凋亡及survivin的表达的影响，研究两者联合用药对HXO-RB44细胞的凋亡及survivin的表达是否具有协同作用。
1材料和方法
1.1材料 HXO-RB44细胞株来自中南大学湘雅医学院肿瘤研究所。胎牛血清为美国Gibco公司产品，RPMI1640培养基购于美国Invitrogen公司。榄香烯乳注射液(elemene)由大连金港制药有限公司生产。VP-16 由齐鲁制药有限公司生产。抗人survivin多克隆抗体购自Santa Cruz公司。FITC购自北京中杉金桥公司。
1.2方法 视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞在37℃ CO2培养箱中培养。取对数生长期的HXO-RB44细胞，调整细胞浓度7.5×107/L,按每孔2 mL接种到6孔培养板中。实验分组：elemene处理组，VP-16处理组，elemene+ VP-16处理组，对照组。每组设6个复孔，分别于培养0、24、48、72h收集细胞。 将对数生长期的HXO-RB44细胞以7.5×107/L加入96孔培养板中,每孔加入180μL的细胞悬液，药物工作液20μL共3块，每组6孔/块），同时每块培养板设6孔对照孔，加入200μL细胞悬液；设6孔零孔，加入200μL培养液。实验孔分别加入不同药物，培养24、48、72h后，每日取出一块，每孔加入20μL MTT,作用4h后,加入DMSO100μL,孵育30min,在酶标仪492nm处测吸光度A值，按如下公式计算抑制率：细胞增殖抑制率=（1-处理孔A均数/对照孔A均数）×100%。另选取生长良好的细胞，调成5× 108/L的悬液，加入不同处理药物后，继续培养24h,收集细胞，加入兔抗人survivin单抗，阴性对照以PBS代替一抗，4℃孵育30min，PBS洗3遍后，用FACstar流式细胞仪检测荧光强度，每个标本检测10 000个细胞。
统计学处理：应用SPSS12.0软件对数据进行统计分析，对符合正态分布的平均数用均数±标准差（ ）表示。对多组均数比较采用单因素多水平设计定量资料的方差分析及相关分析。以P <0.05作为差异有统计学意义。
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