【摘要】 目的：骨桥蛋白(osteopontin，OPN)和血管内皮生长因子（VEGF）与增生性疾病关系密切，我们实验的目的是分析增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreous retinopathy，PVR）前房液中OPN与VEGF的水平，探讨OPN,VEGF与PVR之间的相关性。方法：取200706/200807总共17例PVR病例的前房液样本（A组），20例年龄相关性白内障病例前房液样本（B组），采用酶联免疫吸附试验（ELISA）同时定量测定前房液OPN及VEGF浓度。结果：前房液中：A组OPN浓度377.0±56.6ng/mL， VEGF浓度521.1±92.4ng/mL；B组OPN浓度286.5±49.3ng/mL, VEGF浓度249.0±83.3ng/mL。A组较B组OPN表达升高（P<0.05)，VEGF表达增高（P<0.05)。结论：PVR时前房液中OPN与VEGF水平增高，说明OPN与VEGF在PVR的发生、发展中可能起到促增生的作用。
【关键词】 骨桥蛋白 VEGF 增生性玻璃体视网膜病变 前房液
0引言
增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreous retinopathy，PVR）是一种玻璃体视网膜增生性疾病，由于致病因素的影响，导致视网膜色素上皮、神经胶质细胞等游走、附着、增生，可形成细胞性膜，进而造成牵拉性视网膜脱离。许多研究已经发现增生相关蛋白OPN存在于各种人类体液，包括血液、尿液及乳液等，而VEGF的研究则更为广泛、细化。然而有关PVR前房液中OPN和VEGF的联合测定却未见明确报道。本实验采用ELISA定量测定OPN和VEGF方法，通过对PVR前房液中OPN与VEGF含量的测定，分析PVR患者与正常人前房液中含量的差异，初步了解OPN和VEGF之间的联系，以及两者与PVR发生、发展之间的关系。
1材料和方法
1.1材料
江苏省人民医院眼科200706/200807共收集17例（男8例，女9例）PVR患者前房液,平均年龄49.1岁(A组)；前房液对照组选取年龄相关性白内障眼的前房液20例(男10例,女10例)，平均年龄56.2岁(B组)。A组与B组间无年龄、性别统计差异。诊断标准参照PVR国际分类法（1983年），直接、间接眼底镜检查。A组均无眼部手术史，行现代闭合式玻璃体切割联合晶状体摘除手术。排除眼外伤、糖尿病、以及高血压、眼底静脉栓塞等引起的牵引性视网膜脱离等病例。所有的患者都知情同意，所有的研究都符合赫尔辛基宣言。开睑后，以0.5g/L碘伏稀释液消毒结膜囊，无菌生理盐水反复冲洗，无菌纱布吸尽结膜囊中残液，以1mL注射器自2∶00位角膜缘进入前房抽取约0.05mL前房液。人OPN试剂盒（Human Osteopontin Immunoassay，Catalog Number DOST00）购自美国R&D公司。采用美国∑550型酶标仪。超纯水、10*pcr buffer、镁离子(25mmol/L)、sybr(50x)（美国invitrogen公司），Taq酶（5U/μL)（产品编号11304029，美国invitrogen公司），dNTPs(25mmol/L)（产品编号BF6901B，TaKaRa 公司），引物（上海英骏公司），采用BIOrad公司的IQ5荧光定量仪器测定。
1.2方法
前房液OPN与VEGF浓度测定:从冰箱中取出标本，置于室温下10min待测。根据ELISA试剂盒的说明，将标准品用稀释液定比稀释，充分混匀。将酶标板各孔依次编号，每孔加RD16100μL，并加入50μL标准液或样品，混匀封口。室温下孵化2h，弃液，冲洗液清洗4次。每孔加入200μL OPN Conjugate,封口室温下孵化2h。弃液，冲洗液清洗4次。避光情况下每孔加入200μL底物显色溶液，混匀，孵化30min。再每孔加50μL反应终止液，混匀。酶标仪550nm处读数，30min内测定各孔吸光度值（A值）。VEGF测定方法类似。根据定比稀释标准品的A值绘制标准曲线，以样品的A值和标准曲线算出样品中OPN与VEGF的含量。
统计学分析:实验数据均以均数±标准差( ±s)表示，使用SPSS 11.5 for Windows软件包进行两样本均数的t检验，P<0.05表示具有显著性差异。
2结果
前房液中：PVR组(A组)OPN浓度377.0±56.6ng/mL， VEGF浓度521.1±92.4ng/mL；正常组(B组)OPN浓度286.5±49.3ng/mL, VEGF浓度249.0±83.3ng/mL。A组较B组OPN表达升高（P<0.05），VEGF表达增高（P<0.05）。
3讨论
增生相关蛋白OPN是一种带负电的分泌性磷酸化糖蛋白，可由多种组织细胞合成与分泌,相对分子质量约44kDa，约含300个氨基酸残基。其在许多系统疾病中被发现参与多种组织细胞对损伤的修复过程，有促细胞移动[1]、黏附和增生分化等功能。PVR作为一种眼部增生性疾病，其病理机制在于视网膜色素细胞（RPE）的迁徙和增生分化，视网膜胶质细胞等协同参与。眼部存在血视网膜屏障，有效地阻断了来自脉管系统对眼内环境的影响。由于存在房水循环的前后部交通和物质交换，并且在一些眼前部疾病前房液中OPN升高[2]推测有旁分泌的存在，前房液中OPN的测定能一定程度上反应PVR时眼内细胞分泌的OPN水平而能分析出OPN与PVR发生之间的联系。本实验测得PVR病例前房液中OPN浓度为377.0±56.6ng/mL,较正常组286.5±49.3ng/mL明显升高，说明了OPN浓度升高与PVR的形成极可能具有非常密切的关系。OPN主要与整合素受体或CD44受体相结合发挥生理作用[3],由整合素介导的RPE细胞与细胞外基质蛋白以及RPE细胞之间的黏附则涉及PVR形成[4]。与OPN含有相同序列结构（RGD序列，ArgGlyAsp）的人工合成或生物提取的可溶性小分子多肽能够竞争性抑制黏附，进而阻止细胞的增生、迁移、分化[5,6]，在体内实验中也能抑制RPE细胞介导的细胞增殖所引起的牵拉性视网膜脱离[2]。这些与本实验中PVR时前房液的OPN浓度升高进而可能促进增生的结论相吻合。VEGF及其受体在正常的角膜各层均有表达,包括上皮层、基质层、内皮层,但其表达量很低，而在眼部一些疾病中则高表达[7]，能促使内皮细胞的增生、迁移,蛋白水解和病理性血管生成[8,9]。PVR时细胞迁移、增生，前房液中的VEGF含量可能由于旁分泌和房水循环而较正常显著增高，显示VEGF对PVR的形成有一定的促进作用。而国内外在眼部的研究也证实了PVR患者玻璃体液中VEGF增高[10]，并认为VEGF可以促进增生膜形成[11]。在其他系统疾病中VEGF能诱导OPN导致上皮细胞迁移[12],并且VEGF与OPN可能呈协同作用，使血管生成促进肿瘤生长和转移，OPN上调VEGF效应,协同刺激内皮细胞迁移和管腔形成。在本实验中前房液的OPN与VEGF含量都显著增高佐证了两者在眼部协同促进PVR形成的关系。为PVR的预防、诊断和治疗提供了新的思维和方法。
总之，明确了OPN与VEGF在PVR前房液中高表达，为继续研究OPN，VEGF与PVR的关系提供了基础。但是PVR的形成是极其复杂的过程，涉及多种细胞因子，如PDGF[13]，TGFb2[14]等，并且可能存在多条生物活性通路激活。细胞的迁徙和增生分化是目前普遍公认的PVR发生机制，但其具体增生机制仍是困扰人们的一个难题，需要进一步的研究来明确。
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