角结膜缘色素性肿物免疫组织化学及图象分析定量测定研究
眼科 1999年第1期第8卷 临床研究
作者：李彬戴京张勇李辽青孙宪丽田玉旺 邢惠清
单位：李 彬戴京 李辽青 孙宪丽 京北京市眼科研究所，100730；张勇 北京同仁医院病理科；田玉旺邢惠清北京军区总医院病理科
关键词：痣；色素；黑变病；黑色素瘤；免疫组织化学；DNA；图象处理；计算机辅助
摘 要 应用自动图象分析和定量病理学技术，结合免疫组织化学染色方法，对50例角结膜缘结膜色素性肿物（结膜色素痣、黑变病、黑色素瘤）测定细胞核内DNA的含量。结果表明：结膜色素痣和黑变病经Melanoma及P53抗体染色均呈现出阴性结果，PCNA染色有少量病例为弱阳性或少量阳性着染。DNA含量测定显示，二倍体～四倍体细胞（2C～4C）分别平均占测定细胞总数的89.28％和82.09％。五倍体细胞及高异倍体细胞（5C及AN）分别平均占测定细胞总数的10 .72％和17.91％。在结膜恶性黑色素瘤中，Melanoma及PCNA抗体染色均呈阳性表达，P53亦基本为阳性结果。DNA含量测定结果显示，2C～4C细胞仅占测定细胞总数的8.77％。而5C细胞及AN细胞则占测定细胞总数的91.23％。免疫组化染色显示出同AIAT测定分析基本相符的结果。本研究结果表明，对肿瘤病变进行细胞内DNA含量的定量测定分析，将有助于弥补普通光镜下常规病理诊断的缺陷和不足，提高病理诊断的完整性和准确性，确定病变的生物学特性和增殖活性，并可对其临床发展趋势作出较为客观的评估。
分类号 R730.2
The quantitative measurement of immunohistochemical and automatic image analysis of melanotic neoplasms in limbus／Li Bin…∥OphthalmolCHN.-1999，8（1）.-38～42（Beijing Institute of Ophthalmology，Beijing 100730）
By using automatic image analysis technology（AIAT） and quantitative pathological method combined with the immunohistochemical stain，we measured DNA content of nuclear in 50 cases of limbus melanotic neoplasm （conjunctival nevus，melanosis ＆ melanoma）.The results demonstrated that nevus andmelanosis showed a negative stain with antibodies of Melanoma and P53．A few cases had a weaklypositive stain or few cell was stained with PCNA.The measurement of DNA content revealed that the amount of 2C～4C respectively were 89.28％ and 82.09％，5C and AN were 10.72％ and 17.91％.In melanoma cases，all tumors were positively stained with antibodies of Melanoma and PCNA，most of cases had positive results with P53．The measurement of DNA showed that the amountof 2C～4C were 8.77％，5C and AN were 91.23％.The immunohistochemical stainhad a coincident result with AIAT.This study indicated that quantitative measurement of DNA content on neoplasm would be helpful to modify the disadvantages in regular pathology diagnosis and enhance perfection and correction of pathlogy diagnosis.It would also beuseful to confirm the biological property and hyperplastic activity of neoplasms and objectively evaluate the developing tendency in clinic.
Subject terms Nevus，pigmented；Melanosis；Melanoma；Immunohistochemistry；DNA；Image proces-sing，computer assisted
角结膜缘结膜色素性肿物（结膜色素痣、黑变病、黑色素瘤）是眼科临床上比较常见的增殖性病变。作为眼科病理医师，在临床病理诊断工作中，经常会遇到对于有些处于交界性增生和生长活跃的结膜色素性病变，如何判断其生长增殖活性及良恶性程度的难题。单靠常规的光镜方法很难作出正确的诊断。本研究应用近年来发展起来的先进的自动图象分析技术（automatic image analysis technology，AIAT），结合应用免疫组织化学研究方法，对于眼部结膜色素性病变的不同病变类型以及病变的不同阶段进行定量测定分析研究，以期利用定量病理学的技术进一步研究了解各种病变的生长增殖活性，判别病变的良恶性，从而建立病理诊断的量化指标，作为辅助常规光镜下诊断的手段，并探讨发现对临床病理诊断有价值的规律。
1 材料和方法
1.1 材料
选用50例北京同仁医院眼科研究所病理室存档的角结膜缘色素性肿物石蜡组织块，其中包括结膜色素痣27例（交界痣15例，复合痣12例），结膜黑变病7例，结膜恶性黑色素瘤16例进行测定分析。
1.2 方法
1.2.1 组织切片制备 组织切片制作按照常规石蜡切片方法，切片厚度为4μm；连续切片五张，以备不同的染色使用。
1.2.2 组织切片染色 分别将组织切片做常规H-E染色，Feulgen染色和三种免疫组织化学染色。
免疫组织化学抗体及染色方法：本研究中选用了三种单克隆抗体，即：Melanoma（黑色素瘤抗体），PCNA（proliferation cell nuclear antigen增殖细胞核抗原抗体）和鼠抗人P53抗体，均为北京中山生物技术有限公司产品。本研究采用ABC酶标法，以PBS液替代一抗作为阴性对照，选用已知染色阳性的肿瘤组织切片作为阳性对照。
1.2.3 图象分析定量测定 本研究采用武汉太阳科技发展公司生产的MPIAS-500型多媒体彩色病理图象分析系统，对病变细胞核内的DNA进行定量测量。
在光学显微镜（×40倍）下选定所要进行测定的病变组织，将光镜下的组织图象经显微摄象系统输入计算机，然后启用自动图象分析系统。首先冻结图象，对所测定组织的背底进行积分光密度测定。然后选取至少50个正常淋巴细胞进行图象测定，取其值作为正常二倍体细胞DNA含量（2C）的参照值。继而，用光标笔采集勾画出拟行测定的细胞轮廓，进行选择性修饰后，通过计算机自动数据统计系统计算出所测细胞核的积分光密度（U值＝光密度×细胞核面积），并以U值表示细胞核DNA的相对含量，打印出直方图和分析结果。直方图横座标表示DNA含量（2C，3C～4C，5C，AN），纵座标表示DNA含量细胞的百分比（％）。以测定细胞的平均积分光密度／淋巴细胞平均积分光密度值（DI值即DNA指数）为基值，计算出每例DNA的倍比值。
2 结果
2.1 免疫组织化学染色结果
免疫组化染色阳性反应物呈棕黄色或棕黑色外观。
（1） Melanoma抗体染色
结膜色素痣27例中，全部呈阴性染色。
结膜黑变病7例中，阴性结果6例。
结膜黑色素瘤16例中，染色均为阳性结果。其中按染色阳性程度，（＋）7例，（＋＋）7例，（＋＋＋）2例。
（2） PCNA抗体染色
结膜色素痣27例中，色素痣部分细胞或少量细胞染色阳性者9例；弱阳性染色4例；阴性结果14例。
结膜黑变病7例中，阳性染色3例，弱阳性染色2例；阴性2例。
结膜黑色素瘤16例中，均为阳性染色结果。其中依据阳性染色的程度，（＋）者5例，（＋＋）者11例。
（3） P53抗体染色
结膜色素痣27例中，均为阴性结果。
结膜黑变病7例中，全部染色阴性。
结膜黑色素瘤16例中，14例阳性染色，其中弱阳性者4例，2例染色阴性。
2.2 图象分析定量测定结果
27例结膜色素痣中，DNA直方图显示主峰位于整倍体细胞部分（2C～4C细胞），分布范围在40.98％～100％之间，平均占测定细胞总数的89.28％。其中2C细胞占54.67％；3C～4C细胞占45.33％；五倍体细胞（5C）及高异倍体细胞（AN）分布范围在0～59.02％之间，平均占测定细胞总数的10.72％。
色素痣27例中有15例交界痣，每例均含一定比例的5C细胞和AN细胞。分布范围在0.83％～59.02％之间不等，平均所占比例为20.03％。在复合痣12例中，8例含有一定比例的5C细胞或／和AN细胞，所占比例范围为1.21％～6.94％，平均占2.27％；复合痣中有4例不含5C和AN细胞，细胞成分仅为2C～4C细胞。
6例结膜黑变病中，DNA直方图的主峰位于2C～4C部分，分布范围在48.69％～100％之间，平均占测定细胞总数的82.09％。其中2C细胞占61.88％；3C～4C细胞占38.12％；5C细胞及AN细胞分布范围在0～51.31％之间，平均占测定细胞总数的17.91％。其中，有4例仅含有2C～4C细胞成分；另3例镜下表现为细胞增生活跃的病变含有不同比例的5C细胞和AN细胞，范围从9.26％～42.86％，平均为18.53％。
16例结膜黑色素瘤中，整倍体细胞（2C～4C）分布范围在0～18.97％之间，平均仅占测定细胞总数的8.77％。DNA直方图主峰位于异倍体细胞（5C及AN）部分，分布范围在81.03％～100％之间，平均占测定细胞总数的91.23％。
以上三种病变每两两之间经统计学（X2检验）分析处理，结果显示：结膜黑色素痣与黑变病两者之间无显著性差异，而黑色素痣与黑色素瘤之间、黑变病与黑色素瘤之间均具有非常显著性差异（P＜0.01）。
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