一氧化氮在8-Br-cAMP对视网膜母细胞瘤细胞株影响中的作用
眼科研究 2000年第4期第18卷 实验研究
作者：邓新国 郭希让 吴景兰 田小莉 丁行振
单位：邓新国 郭希让 田小莉 丁行振（450003郑州，河南省眼科研究所）；吴景兰（河南医科大学组胚教研室）
关键词：视网膜母细胞瘤；神经元特异性烯醇酶；一氧化氮；细胞分化；凋亡
摘要 目的研究8-Br-cAMP对人视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞作用后产生一氧化氮（NO）的效应，以探讨HXO-Rb44细胞分化和凋亡的机制。方法应用原位杂交和RNA斑点印迹技术检测NOS mRNA及Bcl-2mRNA；应用硝酸还原酶法检测NO的含量；应用蛋白斑点印迹技术检测一氧化氮合成酶（NOS）的酶活性；应用免疫细胞化学及蛋白质斑点印迹技术检测NSE的免疫反应性（IR）。结果NOS mRNA，NOS酶活性，NO含量和NSE-IR均为实验组（EG）强于对照组（CG）(P＜0.01），而Bcl-2mRNA为EG弱于CG（P＜0.05），并在EG标本上可见HXO-Rb44细胞呈现神经样的突起。结论8-Br-cAMP可使HXO-Rb44细胞生成NO增加，促进NOS的酶活性和NOS mRNA的表达，提高NSE-IR，并降低Bcl-2mRNA的表达。结果表明，8-Br-cAMP具有促使HXO-Rb44细胞向神经细胞分化并诱导该细胞凋亡的效应，提示NO可能参与此效应。
分类号 R774
The effect of nitric oxide induced by the 8-bromo-cyclic AMP in the
human retinoblastoma HXO-Rb44 cells
Deng Xinguo Guo Xirang Wu Jinglan et al．
（Henan Institute of Ophthalmology，Zhengzhou 450003）
Abstract ObjectiveTo study the effect of nitric oxide（NO） induced by the 8-Br-cAMP in the human retinoblastoma HXO-Rb44 cells．The aim is to investigate the mechanism of cell differentiation and apoptosis induced by 8-Br-cAMP．MethodsThe NOS mRNA and Bcl-2mRNA were detected with biotin-labeled NOS-cDNA probe by in situ hybridization and RNA dot blot．The NOS activity was detected by protein dot blot．NSE immunoreactivity（IR） was detected by immunocytochemistry and protein dot bolt．The NO was detected by nitrate reductase method．ResultsThe NOS mRNA signal and NSE-IR were localized in the cytoplasm．The signals of NOS mRNA，NOS activity，NSE-IR and NO content in the EG were all higher than those in the CG（P＜0.05～0.01）．The signals of Bcl-2mRNA was lower in the EG than in the CG．Besides，the neurite-like processes in EG could be observed．ConclusionsThe results show that 8-Br-cAMP could increase NO product，NOS activity，NSE-IR （as the neuron specific marker） and the expression of NOS mRNA and decrease the expression of Bcl-2mRNA．It indicates that 8-Br-cAMP could facilitate synthesis of NO in the HXO-Rb44 cells and have tendency toward neuron development and lead to cell apoptosis，suggesting that the increased NO may involve cell differentiation and apoptosis in the retinoblastoma HXO-Rb44 cells．
Key Words retinoblastoma neuron specific enolase nitric oxide cell differentiation apoptosis
有报道，视网膜母细胞瘤Y79细胞株受到一定的因素作用后，如维甲酸、8-Br-cAMP处理，可向神经细胞或向M%26uuml;llers胶质细胞方向分化［1，2］。8-Br-cAMP与8-Cl-cAMP、双酊酰（DB）-cAMP均属cAMP受体蛋白的RIIα亚型选择性位点结合类似物，与RIIα亲和性强，呈现抑制多种肿瘤细胞增殖及促进细胞分化的作用［3，4］。8-Br-cAMP与8-Cl-cAMP相比较，前者促分化作用较强，无任何毒性，而后者代谢物8-Cl-腺苷毒性强，可促使细胞凋亡和死亡［5］。神经元特异性烯醇酶（neuron specific enolase,NSE）可作为神经元分化的标志［6］，有研究报道，一氧化氮（nitric oxide，NO）参与了神经元和神经母细胞瘤SK-N-BE细胞株的分化［7，8］，而Bcl-2基因是凋亡抑制基因［9］。关于8-Br-cAMP对人视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞的分化和凋亡效应以及NO在引起这些效应中的变动，至今未见报道。
1 材料与方法
1．1 HXO-Rb44细胞标本的制备
将体外培养的人视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞系（湖南医科大学赠）等分为两组，一组为加终浓度2×10－5mol／L8-Br-cAMP（Sigma）的实验组（experimental group，EG），另一组为不加8-Br-cAMP的对照组（control group，CG），培养24h，调整细胞数为1×107ml，将两组的细胞悬液分别滴于硝酸纤维素膜（nitrocellulose membrane，NCM）（Life Tech）和玻片上，制备NCM和玻片两种标本。
1．2 斑点印迹和原位杂交检测NOS mRNA和Bcl-2mRNA［10］
NOS-cDNA和Bcl-2-cDNA裸探针购自北医分子病理室。
1．3 间接免疫酶标组化法检测NSE［10］
NSE（鼠抗，DAKO）购自北京中山生物技术有限公司。
1．4 硝酸还原酶法检测NO含量
将EG和CG的HXO-Rb44细胞用0.01mol／LPBS缓冲液洗两次（1500r／min，5min），每管最终加PBS0.5ml，超声粉碎，立即用一氧化氮检测试剂盒（南京聚力生物工程研究所产品）进行实验，用紫外分光光度计（Shimadu）检测标本的消光值，根据公式计算NO的浓度（用μmol／L表示）。
1．5 组织化学法检测NOS（nitric oxide synthase,Nos）
取EG，CG各9个NCM样本放入96孔板内，加底物液（β-NADPH1mg及NBT0.5mg加入0.01mol／LPBS，pH8.0，1ml）孵育1～2h，以D．H2O终止反应。玻片标本同上。以不加底物作为对照标本。
1．6 结果判定
用岛津薄层层析扫描仪（波长为530nm）对NOS mRNA和Bcl-2mRNA杂交信号以及NOS，NSE蛋白的斑点印迹信号进行扫描测定其相对光密度值（optical density，OD）。在油镜下观察原位杂交信号及免疫组化反应的定位。结果经t检验进行统计学分析。
2 结果
2．1 视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞内NOS mRNA及NSE蛋白的定位
应用碱性磷酸酶显色体系NOS mRNA杂交信号和NSE的免疫反应性（IR）均呈紫色细颗粒，并位于细胞质，在EG标本上可见HXO-Rb44细胞呈现神经样突起（见图1，2）。
2．2 8-Br-cAMP对HXO-Rb44细胞NSE-IR,NO含量,NOS酶活性和NOS mRNA及Bcl-2mRNA基因表达的效应（见表1）
图1 人HXO-Rb44细胞NOS mRNA原位杂交信号，a为实验组（EG），b为对照组（CG），信号细颗粒位于细胞质，EG强于CG（×1000）；c为NOS mRNA斑点印迹信号，EG强于CG 图2 人HXO-Rb44细胞NSE免疫组化反应性，a为实验组（EG），b为对照组（CG），免疫反应细颗粒位于细胞质，EG强于CG（×1000），在EG组可见HXO-Rb44细胞呈现神经样突起；c为NSE蛋白斑点印迹信号，EG强于CG
Fig．1 NOS mRNA in situ hybridization signal in human HXO-Rb44 cells（Fig a：experiment group，EG；Fig b：control group，CG）．The signal as localized in the cytoplasm，EG stronger than CG（×1000）；Fig c：NOS mRNA dot bolt signal，EG stronger than CG.
Fig．2 NSE-IR in human HXO-Rb44 cells（Fig a：experiment group，EG；Fig b：control group，CG）．The IR localized in the cytoplasm，EG stronger than CG（×1000）．In the EG，some neurites projected from the retinoblastoma cells were found under observation with the microscope；Fig c：NSE protein dot blot signal，EG stronger than CG
由表1所示，经统计学处理，实验组NOS mRNA基因表达信号，NSE-IR，NOS活性及NO含量与对照组比较，EG＞CG，有显著差异，P＜0.01～0.05，而Bcl-2mRNA基因表达信号为EG＜CG。结果表明，8-Br-cAMP可促进HXO-Rb44细胞NO的生成和NOS mRNA的表达，提高NOS的活性及NSE的免疫反应性，降低Bcl-2mRNA的基因表达。
3 讨论
3．1 视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞的分化
视网膜母细胞瘤是一种有分化潜力的干细胞，在不同因素的作用下，视网膜母细胞瘤可向视网膜的视锥及视杆细胞、色素上皮细胞和M%26uuml;llers胶质细胞方向分化［1］。NSE可作为神经元分化的特异性标志。易玉珍等人［6］报道视网膜母细胞瘤细胞主要向神经细胞方向分化，Fassina等人［1］的研究结果表明，8-Br-cAMP可提高视网膜母细胞瘤Y-79细胞株表达NSE，促进该细胞向神经细胞方向分化。本实验观察到HXO-Rb44细胞经8-Br-cAMP处理后呈现神经样突起并提高作为神经元分化特异性标志的NSE的表达，表明8-Br-cAMP可促使人HXO-Rb44细胞向神经细胞方向分化。
3．2 NO在8-Br-cAMP对视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞分化和凋亡中的作用
NO及NOS广泛存在于神经元，有报道［11］NO作为细胞的信息分子具有多种功能，如舒张血管、提高巨噬细胞免疫功能和有利于中枢及外周神经系统间的神经传递作用，NO不但参与神经递质释放、神经发育、突触的形成以及基因表达的调节，而且在细胞的分化和凋亡中起重要作用。Shami等人［12］报道，NO可抑制急性非淋巴细胞白血病的生长，诱导其分化和调节其基因的表达。Ogura等人［13］发现在分化的神经母细胞瘤TGW细胞株内神经元NOS活性和NOS mRNA表达均增高。Xie等［14］报道NO可诱导K-1735黑色瘤细胞的凋亡与Bcl-2基因的下调有关，而Bcl-2是调控细胞凋亡的重要基因［9］，其产物能抑制细胞凋亡。Chen等人［15］也报道，cAMP类似物，如8-Br-cAMP，DB-cAMP等具有抑制恶性胶质细胞瘤A-172细胞增殖、促进分化、诱导凋亡的作用。
本实验观察到，8-Br-cAMP可促进HXO-Rb44细胞产生NO，增加NOS酶活性及NOS的基因表达，降低Bcl-2mRNA的基因表达，表明NO的产生是受其相应基因及酶控制的，在8-Br-cAMP诱导HXO-Rb44细胞的分化和凋亡过程中，NO可能起了关键作用。
本文受河南省科委攻关课题资助（课题编号：971200261）
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