作者：李鹏程，陈小敏，张缨，胡燕华    作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院 眼科，湖北 武汉 430022

    【摘要】  目的 探讨基质细胞衍生因子（stromal cell-derived factor-1, SDF-1）及其受体CXCR4在翼状胬肉的表达及意义。方法 用免疫组织化学染色方法对4例正常人结膜组织、11 例初发性翼状胬肉和9 例复发性翼状胬肉组织中SDF-1/CXCR4蛋白的表达进行检测。结果 　在正常结膜组织中SDF-1/CXCR4仅表达于基底部上皮细胞；胬肉组织中有17例，全层上皮细胞均有SDF-1/CXCR4的表达，胬肉基质层中浸润的炎性细胞、血管内皮细胞均有CXCR4的蛋白表达；3例初发性翼状胬肉表达方式与正常结膜相似。结论 　翼状胬肉组织SDF-1及其受体CXCR4蛋白表达增加；上皮细胞分泌的SDF-1通过与其受体CXCR4的相互作用可能参与了翼状胬肉的血管形成和炎性细胞浸润。

    【关键词】  翼状胬肉；结膜；基质细胞衍生因子；受体CXCR4

    Department of Ophthalmology, the Union Hospital Affiliated to Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan China，430022

    ［Abstract］  Objective  To investigate the expression of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) and its receptor CXCR4 in human pterygium. Methods  Immunohistochemistry staining was performed on 11 primary pterygium samples, 9 recurrent pterygium samples, and normal conjunctiva. The immunhistochemistry stainings were used to compare the distribution of SDF-1/CXCR4 in pterygium. Results  SDF-1/CXCR4 was present in the basal epithelial cells of normal conjunctiva. Of 20 pterygia cases, 17 expressed SDF-1/CXCR4 in the full thickness of the epithelium and CXCR4 was also found in the inflamed cells and vascular endothelial cells in the tissues; 3 primary pterygium cases showed the same staining pattern as that in normal conjunctiva. Conclusion  Expression of SDF-1/CXCR4 increased in pterygium, the SDF-1 secreted by the epithelium may participate in inflammatory cell infiltration and angiopoiesis in pterygium formation.

    [Key words]  pterygium; conjunctiva; stromal cell-derived factor-1; CXCR4　

    翼状胬肉是一种侵犯眼表的增殖性炎性眼病，在赤道地区及户外工作者中发病率较高[1]，其发病与紫外线以及机体的免疫反应等多种因素有关，但其具体机制仍不清楚。组织学上分析，它主要由变性的球结膜和高度血管化及弹力纤维变性的结缔组织构成。近年的研究资料表明，基质细胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)及其受体CXCR4除参与新生血管的形成外，还与多种免疫相关的疾病有关。为此，我们对翼状胬肉组织标本中趋化因子SDF-1及其受体CXCR4的表达进行免疫组化观察，探讨其在翼状胬肉形成过程中的作用。

    1  材料和方法

    1.1  标本来源

    共收集本院11 例初发性翼状胬肉（均为进展期）和9例复发性翼状胬肉患者的手术标本，其中男性 13 例，女性 7例，年龄 32～61岁。所有标本取得患者的同意。正常结膜4 例，取自猝死尸体，均在死后 12 h内获取。取得标本后立即用甲醛固定并用石蜡包埋。

    1.2  主要试剂

    小鼠抗人SDF-1单克隆抗体，小鼠抗人CXCR4单克隆抗体 (购自R&D公司)。免疫组化SP试剂盒，DAB显色剂，中性树胶（以上试剂均由中山公司提供）。

    1.3  免疫组织化学Envision法检测大鼠角膜SDF-1及其受体CXCR4的表达

    石蜡标本行4 μm厚连续切片，切片行常规二甲苯脱蜡，梯度酒精复水。用3%过氧化氢-甲醇溶液处理切片15~30 min，PBS缓冲液洗涤5 min，共3次。在柠檬酸盐缓冲液中微波修复抗原，中高火，5 min，共2次，自然冷却。用PBS缓冲液漂洗。甩干PBS，用正常山羊血清在室温孵育15~30 min，以封闭组织中非特异性抗原。甩去多余血清，加小鼠抗人SDF-1及小鼠抗人 CXCR4单克隆抗体（工作液浓度均为20 μg/ml），PBS代替一抗为阴性对照。置入湿盒于4℃冰箱孵育18 h。PBS缓冲液充分洗涤，去除切片上非特异性吸附抗体。甩干PBS，加入生物素标记的二抗工作液，置湿盒内37℃孵育30 min，用PBS洗涤5 min，共3次。甩干PBS，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，置湿盒内37℃孵育30 min，PBS洗涤5 min，共3次。DAB显色，苏木素复染。梯度酒精脱水，二甲苯透明，晾干后中性树胶封片。光镜下观察照相。

    2  结果

    4例正常结膜组织的SDF-1及其受体CXCR4仅表达于基底部上皮细胞，位于胞浆中，表现为胞浆及胞膜呈棕黄色。上皮下组织未检测到二者表达（见图1）。

    胬肉组织中有17例全层上皮细胞均呈棕黄色，即都有SDF-1及其受体CXCR4的表达（见图2），CXCR4的蛋白表达也见于胬肉纤维血管中浸润的炎性细胞、血管内皮细胞中，其胞浆及胞膜呈棕黄色颗粒（见图3）。3例初发性翼状胬肉表达方式与正常结膜相似。

    3  讨论

    翼状胬肉形成的复杂病理过程由多种因素参与。目前肯定的因素有紫外线照射、血管增殖及免疫因素，如大量肥大细胞的浸润[2]；其发生还与抗血管生成的因子和促血管生成因子的失衡有关。作为眼表重要的抗血管生成因子，正常角结膜上皮表达色素上皮来源因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF），而翼状胬肉组织无PEDF的表达却有大量的VEGF和FGF表达[3]。

    SDF-1是近年来发现的一种CXC类趋化因子，最早从骨髓基质细胞中分离得来，后来发现它还存在于角膜基质细胞、视网膜色素上皮细胞和肺的成纤维细胞等。它对各种白细胞，如嗜碱性粒细胞、单核细胞、单核－巨噬细胞以及血小板、CD34+的造血祖细胞、各种造血祖细胞等表现出很强的趋化作用。CXC4是SDF-1的惟一生理受体，SDF-1也是CXCR4的惟一配体[4]。它广泛表达于多种类型的组织干细胞以及多种成熟体细胞中，如外周血细胞和血管内皮细胞等。SDF-1/CXC4则广泛地参与各种炎症性疾病和新生血管的形成。本研究通过观察SDF-1及其受体CXCR4在翼状胬肉上皮的表达，旨在探讨其在翼状胬肉发病机制的作用。

    我们的研究发现翼状胬肉的上皮细胞各层都有SDF-1的表达，其水平明显高于正常结膜。CXCR4除表达于上皮细胞外也见于血管内皮细胞内等。SDF-1及其受体CXCR4的表达水平提高可能在翼状胬肉的血管增殖过程中发挥作用。研究表明，翼状胬肉上皮细胞是各种细胞因子的重要来源。在紫外线作用下，培养的翼状胬肉上皮细胞可以分泌血管内皮生长因子以及与血管生成有关的趋化因子IL-6，IL-8等[5]，从而在胬肉的发生发展中发挥重要作用。我们认为其促纤维血管增殖作用机制至少包括两方面：对血管内皮细胞的直接趋化作用；通过其与受体CXCR4的结合，促进多种细胞VEGF分泌增加，两者协同促进纤维血管组织增殖，阻止新生血管内皮细胞凋亡[6]。

    高表达的SDF-1还可能通过其对造血干细胞的趋化作用而参与胬肉发生过程中的增殖及免疫反应。Lee等[7]研究发现，翼状胬肉组织中有大量血管内皮干细胞，且患者循环中CD34+单个核干细胞数量高于正常对照，循环和局部的细胞因子如P物质、VEGF、干细胞因子都高于正常人，并与干细胞数量成正相关。Song等[8]也发现干细胞标记蛋白表达于胬肉组织基底部上皮细胞、基质的血管内皮、成纤维细胞中。作为各种造血干细胞的重要的趋化因子[9]，我们推测高表达的SDF-1可能与其他细胞因子一起发挥对干细胞的趋化和滞留作用。此外，高表达的SDF-1还可能通过其对各种炎性细胞的趋化作用而参与胬肉发生过程中的免疫反应。它可能趋化CD4+ T细胞到胬肉组织，并且抑制激活诱导的T细胞凋亡而参与胬肉的发病[10]。

    总之，SDF-1及其受体CXCR4在翼状胬肉组织中的高水平表达，可能通过血管增殖、炎性细胞浸润等环节参与胬肉的发生发展过程。

    【参考文献】

     [1] Wong TY, Foster PJ, Johnson GJ, et al. The prevalence and risk factors for pterygium in an adult Chinese population in Singapore: the Tanjong Pagar survey[J]. Am J Ophthalmol，2001，131(2):176-183.

    [2] 钟一声,丁侃,叶纹,等. 翼状胬肉中碱性成纤维细胞生长因子的表达及其与肥大细胞的关系[J]. 中华眼科杂志，2001，37(6)：455-457.

    [3] Jin J, Guan M, Sima J, et al. Decreased pigment epithelium-derived factor and increased vascular endothelial growth factor levels in pterygia[J]. Cornea，2003，22(5):473-477.

    [4] D'Apuzzo M, Rolink A, Loetscher M, et al. The chemokine SDF-1, stromal cell-derived factor 1, attracts early stage B cell precursors via the chemokine receptor CXCR4[J]. Eur J Immunol，1997，27(7):1788-1793.

    [5] Di Girolamo N, Wakefield D, Coroneo MT. UVB-mediated induction of cytokines and growth factors in pterygium epithelial cells involves cell surface receptors and intracellular signaling[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2006，47(6):2430-2437.

    [6] Kryczek I, Lange A, Mottram P, et al. CXCL12 and vascular endothelial growth factor synergistically induce neoangiogenesis in human ovarian cancers[J]. Cancer Res，2005，65(2):465-472.

    [7] Lee JK, Song YS, Ha HS, et al. Endothelial progenitor cells in pterygium pathogenesis[J]. Eye，2007，21(9):1186-1193.

    [8] Song YS, Ryu YH, Choi SR, et al. The involvement of adult stem cells originated from bone marrow in the pathogenesis of pterygia[J]. Yonsei Med J，2005，46(5):687-692.

    [9] Grunewald M, Avraham I, Dor Y, et al. VEGF-induced adult neovascularization: recruitment, retention, and role of accessory cells[J]. Cell，2006，124(1):175-189.

    [10] Nanki T, Hayashida K, El-Gabalawy HS, et al. Stromal cell-derived factor-1-CXC chemokine receptor 4 interactions play a central role in CD4+ T cell accumulation in rheumatoid arthritis synovium[J]. J Immunol，2000，165(11):6590-6598.