【摘要】 目的：大鼠自身免疫性葡萄膜视网膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis, EAU)大鼠模型眼部研究细胞因子信号抑制因子（suppressor of cytokine signaling,SOCS）的表达。方法：用光感受器间维生素A类结合蛋白(interphotoreceptor retinoidbinding protein, IRBP)免疫Lewis鼠160只后，在眼组织切片上应用SOCS多克隆抗体进行免疫组织化学染色，观察其在眼组织中的表达并与正常大鼠40只做对照。结果：用IRBP免疫Lewis鼠后，免疫组织化学染色发现在虹膜、睫状体和视网膜部位可见SOCS1和SOCS5蛋白表达；而在正常Lewis鼠未见SOCS蛋白表达。统计学结果显示，SOCS1和SOCS5蛋白表达与EAU严重程度呈正相关（r1=0.954,r2=0.963,P<0.01）。结论：自身免疫性葡萄膜视网膜炎Lewis鼠出现SOCS阳性表达细胞在EAU的发病过程中起了一定的作用。
【关键词】 SOCS；实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎
Study on the expression of suppressor of cytokine signaling in experimental autoimmune uveoretinitis
Liang Liang, Hong Wang, XiaoYan Peng
Foundation item: Nationtal Natural Science Foundation of China (No. 30772013)
Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Lab, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing 100730, China
Abstract AIM: To investigate the expression of suppressor of cytokine signaling (SOCS) positive cells involved in experimental autoimmune uveoretinitis (EAU). METHODS: Immunohistochemical staining was performed using polyclonal antibodies to SOCS on ocular sections of 160 Lewis rats after immunized with interphotoreceptor retinoidbinding protein (IRBP), and 40 normal ones as controls. RESULTS: SOCS positive cells were not detected in ocular sections from normal Lewis rats. In the ocular sections of Lewis rats with EAU, SOCS1 and SOCS5 positive cells were clearly detectable in the parts of iris, ciliary body and retina. Statistical analysis showed that there was a positive correlation between the expression of SOCS1 and SOCS5 positive cells and the degree of inflammation in EAU(r1=0.954, r2=0.963, P<0.01).CONCLUSION: The expression of SOCS positive cells in the Lewis rats is significantly distinct from the normal ones. Its likely that SOCS positive cells may be contributed to the inflammatory responses of the eye in EAU.
KEYWORDS:SOCS;experimental autoimmune uveoretinitis
葡萄膜炎是临床常见的致盲眼病，其发病机制目前尚不清楚。但大量研究表明，自身免疫因素在葡萄膜炎发病过程中起了很大作用，患者体内的Th1型免疫反应增强[1]。最近研究发现，细胞因子信号抑制因子（suppressor of cytokine signaling,SOCS）参与自身免疫疾病的发病过程[2]。SOCS包括8个成员即含SH2结构的细胞因子诱导蛋白（CIS）和SOCS1～ SOCS7；在细胞因子诱导下依赖JAK/STAT通路的激活而产生，继而抑制细胞因子的信号传导，因此SOCS蛋白是一种细胞因子信号传导的负反馈调节因子[2 4]。EAU作为一种常用的葡萄膜炎动物模型，其病理特征与临床特点与人类葡萄膜炎有许多相似之处，从而为葡萄膜炎发病机制的探索提供了良好的研究工具。我们观察了SOCS在EAU大鼠眼部组织的表达如下。
1材料和方法
1.1材料 纯系雌性Lewis大鼠200只,6～8周龄，体质量150～200g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。氟氏完全佐剂（北京欣经科生物有限公司），IRBP多肽片断ADGSSWEGVGVVPDV(上海生物有限公司)，一抗山羊抗大鼠SOCS1～SOCS7和CIS多克隆抗体和二抗生物素化驴抗羊ABC免疫组织化学试剂盒（Santa Cruz Biotechnology公司，美国）。
图1 A:IRBP免疫后10d;B: IRBP免疫后14d（略）
图2EAU大鼠眼组织病理（HE×20）（略）
A:前房及玻璃体内炎细胞浸润，视网膜脱离;B：炎性细胞浸润及组织破坏
1.2方法 随机将大鼠分为正常对照组40只与实验组160只。100g/L水合氯醛0.5mL iv后，将IRBP 100μg与等量氟氏完全佐剂注射于实验对照组160只大鼠的右后足底部。在免疫前及免疫后7,10,11,12,13,14,21,28d,用裂隙灯显微镜对大鼠进行细致的临床检查,根据de Smet等[5]的标准对炎症进行分级；0级为无炎症；0.5级为轻度虹膜睫状体炎，瞳孔红光反射轻度模糊；1级为中度虹膜睫状体炎，瞳孔不规则，红光反射模糊；2级为重度虹膜睫状体炎，出现虹膜后粘连，瞳孔膜闭，前房积脓；3级为极重度虹膜睫状体炎，有大量前房积脓；4级为全眼球炎，伴有出血、角膜新生血管和眼球突出。免疫后7,14,21,28d随机取实验组大鼠40只，100g/L水合氯醛0.5mL iv麻醉后,用5mU/L肝素0.3mL注射至左心室以抗凝血。通过左心室用300mL冷的磷酸盐缓冲液(PBS)灌注动物，以排出毛细血管床内所有血液及血源性成分，然后取眼球制作冰冻切片。正常对照组采用相同的方法取材。用标准ABC方法对IRBP免疫鼠320眼，正常鼠80眼组织切片进行免疫组织化学染色。将眼球切片置于含10mL/L H2O2 PBS中孵育20min，以灭活内源性过氧化酶，标本在4℃与一抗孵育过夜，然后与生物素标记的驴抗山羊抗体孵育1h，用卵白素生物素过氧化酶复合物和3, 3二氨基联苯胺(DAB)对其进行染色，阳性细胞呈棕黄色，苏木素复染后封片。用0.01mol/L PBS代替一抗孵育，作为阴性对照。以背景清晰、细胞质内出现黄色或棕黄色为阳性信号。阳性细胞计数以每个 (400倍)视野计数100个细胞中的阳性细胞数,每个标本计算3个视野,取其平均值。根据染色强度和显色细胞比例综合评分,将染色结果分为“,+,++,+++”4级。(1)按增生膜组织显色有无及深浅评分:无显色为0分,浅黄色为1分,黄色或棕黄色为2分,棕褐色为3分；(2)按阳性细胞比例评分:阳性细胞计数<5%者为0分,5%～30%者为1分,30%～60%者为2分,>60%者为3分。每例标本的积分为[(1)+(2)]÷2,按积分高低分为:0分为阴性(),0.5～1分为弱阳性(+),1.5～2分为阳性(++),2.5～3分为强阳性(+++)。
统计学分析：应用SPSS 11.5统计软件进行两样本等级资料的非参数统计方法检验EAU大鼠临床表现与SOCS阳性表达量之间有无相关性。
2结果
2.1临床病理观察 大鼠免疫后10d，在裂隙灯显微镜下可观察到炎症，14d炎症最为明显(图1A，B)，28d基本消退。分别表现为眼底红光反射模糊, 房水中有渗出,角膜新生血管，虹膜后粘连及前房积脓。7，14，21，28d各组大鼠平均得分为0.5，3.0，2.0和0.2。实验组大鼠眼组织切片HE染色可见不同程度的炎症表现。主要表现为：炎性细胞的浸润、组织水肿、浆液性视网膜脱离、光感受器细胞的破坏，视网膜萎缩等（图2A，B）。
2.2免疫组织化学检测结果 实验对照组7,14,21和28d组织切片中可见在虹膜、睫状体和视网膜组织中SOCS1和SOCS5呈阳性表达，14d最为明显（图3A,B,C），随后逐渐消退。而在正常大鼠及阴性对照中未见明显阳性染色（图4A,B,C）。7，14，21，28d组的平均得分分别为1,3,2,0.5。对EAU大鼠临床表现与SOCS1和SOCS5阳性表达量相关性分析结果显示，EAU大鼠临床表现严重程度与IL17表达量呈正相关（r1=0.954,r2=0.963;P<0.01）。
图3大鼠IRBP免疫后14d眼组织SOCS1表达（SABC×400） （略）
A：虹膜SOCS1阳性；B：睫状体大量SOCS1阳性；C视网膜SOCS1阳性
图4正常大鼠眼组织SOCS1阴性（SABC×400）（略）
A：虹膜；B：睫状体；C：视网膜
3讨论
研究表明，未致敏CD4+T细胞在受到抗原刺激后，主要分化为Th1和Th2两个亚群。现已证实，Th1细胞主要参与细胞免疫，Th2细胞主要参与体液免疫，二者数量及功能的平衡是维持机体免疫功能稳定的基础。如果这一平衡遭到破坏，就会造成免疫功能紊乱，引起免疫病理损伤，如当Th1细胞占优势时，细胞免疫功能亢进，引起诸如葡萄膜炎、Crohn病、多发性硬化等自身免疫性疾病，Th2细胞占优势时，则引起体液免疫功能亢进所致的疾病如过敏反应、哮喘等。因此，深入研究Th1/Th2细胞分化机制，有目的地调节免疫应答，有利于免疫紊乱的治疗和康复，对于探讨葡萄膜炎等自身免疫性疾病的发病机制、预防及治疗均有重要意义。
Th1/Th2细胞在体内的分化受到多种因素的调节，越来越多的研究表明细胞因子起最重要的调节作用，如IL12和IFNγ可诱导前体Th0细胞向Th1细胞方向分化，IL 4则可促进Th2细胞的分化。近年来对细胞因子作用机制的研究证实，当细胞因子作用于靶细胞表面受体时，都要通过总称为信号转导因子的一系列信号分子，才能将刺激信号传到核内而发挥其对基因转录的调节作用，并启动靶细胞的相应生理效应，细胞信号转导通路在此起了重要的中介作用。其中JAK /STAT（Janus kinas，JAK激酶/signal transducer and activators of transcription，信号转导及转录激活因子）通路是细胞因子发挥其生物效应最普遍且最重要的细胞内信号传导通路[6]。新近发现，这些途径受细胞因子信号抑制因子（SOCS）的负反馈调节，通过选择性抑制IL12/STAT4或IL 4/STAT6途径的信号传导，实现对Th细胞的分化调控[2 4]。SOCS蛋白起初作为一种新型含SH2结构的细胞因子诱导蛋白而被发现的，至此已发现8个成员（CIS，SOCS1～SOCS7），有共同的结构元件：可变的N端，中间的SH2域及保守的C端SOCSbox，统称为细胞因子信号抑制因子，并被命名为SOCS家族[7]。大多数SOCS基因（CIS，SOCS1～SOCS3）的转录和蛋白质的合成可以被细胞因子诱导，包括IFNγ，IL2，IL3，IL 4，IL6，IL12，IL13，LIF（白血病抑制因子），GH，GMCSF，EPO（红细胞生成素）和PRL（泌乳素）等。体外实验的研究表明，SOCS1的过度表达可以抑制许多细胞因子的信号传导，如IL2，IL3，IL 4，IL6，LIF，IFNγ，IFNα，IFNβ，PRL和GH等；SOCS2能抑制胰岛素样生长因子1信号；SOCS3能抑制IL12应答[810]。SOCS在细胞因子诱导下依赖JAK/STAT通路的激活而产生，继而抑制细胞因子的信号传导，因此SOCS蛋白是一种细胞因子信号传导的负反馈调节因子。它们通过负反馈方式调节细胞因子启动的JAK/STAT传导通路，其作用机制包括：与JAK结合而抑制激酶活性，竞争性抑制STAT与活化受体的结合而抑制STAT的激活，以及介导信号蛋白依赖蛋白酶体的降解过程[11]。
最近对IL 4和IL12通过STAT/SOCS信号途径对Th细胞分化调节机制的研究发现，这些因子的信号途径对Th1/Th2细胞的极化与不同的SOCS成员的表达有关[2 4]。Th1细胞高度表达SOCS1，SOCS3很少表达；相反，Th2细胞高度表达SOCS3，少量表达SOCS1。SOCS1在Th1细胞高表达，抑制了IL4/STAT6信号的传导，从而抑制了Th2细胞分化，而促进了Th1细胞的分化；SOCS3在Th2高表达，通过抑制IL12/STAT4通路抑制了Th1细胞分化，从而促进Th2细胞的分化。这表明具有Th1或Th2表型的细胞与其表达的SOCS成员有密切关系，据此认为不同的SOCS成员可作为Th1/Th2极化细胞的标记，也将是免疫调节治疗的靶分子。已有研究证实，SOCS1在Th1细胞介导的自身免疫性疾病如多发性硬化、Crohn病、实验性自身免疫性脑脊髓膜炎中起重要作用；而SOCS3是引起Th2细胞介导的自身免疫性疾病如哮喘的重要病理因素[1215]。我们已证实，在EAU大鼠外周血单个核细胞内SOCS1和SOCS5 mRNA表达明显高于正常大鼠;CIS和SOCS3 mRNA表达轻度升高[16]。但IL17蛋白在EAU动物模型眼部表达的研究仍未见到相关报道。我们证实，SOCS1和SOCS5蛋白在EAU动物模型虹膜、睫状体、视网膜组织中均有表达；SOCS1和SOCS5蛋白在眼前节表达量明显高于后节，这与EAU的病理特点相一致，并且表达量与眼部炎症程度变化相一致。而在正常动物与阴性对照组织中未见到SOCS蛋白的表达。因此可以得出，SOCS1和SOCS5阳性表达细胞参与了EAU的发生，它们可能参与了Th1细胞因子介导的炎症过程。本研究进一步证实了SOCS在葡萄膜炎发病过程中的作用和地位，从而为将SOCS作为一个新的治疗葡萄膜炎的靶点提供了有力证据。
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