【摘要】 目的：观察内皮抑素（endostatin, ES）对视网膜新生血管中血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达的影响。方法：通过缺氧的方法建立小鼠视网膜新生血管模型36只，随机分为高氧组及ES治疗组。ES治疗组小鼠在出氧箱后12,36h，玻璃体腔内注射ES 1μL。另将生活在正常氧环境中的18只同龄小鼠作为正常对照。提取3组小鼠视网膜总RNA，通过RTPCR方法定量检测VEGF在3组小鼠视网膜中的表达。结果：氧致视网膜病变视网膜中VEGF的表达升高，与正常对照组比较有统计学意义（高氧组与正常对照组比较P<0.05）；ES作用后VEGF的表达减少，与给氧组比较有统计学意义（ES治疗组与高氧组比较P<0.05）。结论：ES作用机制可能是通过抑制VEGF mRNA基因的表达来抑制视网膜新生血管的形成。
【关键词】 视网膜新生血管化；内皮抑素；疾病模型；血管内皮生长因子；荧光定量聚合酶链反应
Effects of endostatin on the expression of vascular endothelial growth factor in the retina of oxygeninduced retinal neovascularization
Jing Wu, MeiXia Zhang, JunJun Zhang, Mi Yan
Foundation items: National Natural Science Foundation of China (No.30500547); Scientific Problem Tackling Program of Sichuan Province, China (No.07KJT04)
The West China Eye Center, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
AbstractAIM: To investigate the effect of endostatin (ES) on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in the retina of oxygeninduced retinal neovascularization. METHODS: Thirtysix oneweekold C57BL/6J mice established the oxygeninduced retinal neovascularization model were randomly divided into hyperoxia group and ES treatment group. In ES treatment group, 1μL endostatin(1g/L) was injected into vitreous after 12 and 36 hours out of the oxygen box. Eighteen mice were cultured in the room air to make the control group. Total RNA were extracted from retinas of three groups, the quantity of VEGF mRNA in retinas was analyzed with quantitative realtime PCR with the special primers. RESULTS: Quantitative realtime PCR results indicated that the expression of VEGF was upragulated in hyperoxia group compared with control group (P<0.05), while in the treatment group the expression of VEGF was downregulated by ES compared with hyperoxia group (P<0.05). CONCLUSION: Endotatin can inhibit the oxygeninduced retinal neovasularization perhaps by downregulating the level of VEGF mRNA which is important to the angiogenesis process.
KEYWORDS: retinal neovascularization; endostatin; disease models; vascular endothelial growth factor; real timePCR
视网膜新生血管及其并发症严重损害视功能，由于其发病机制尚未完全明了，因此目前仍无确切有效的药物治疗方法。内皮抑素（ES）是当前抗新生血管疗法中最有潜力的一种药物蛋白，为了研究ES对视网膜新生血管的抑制作用，我们建立氧致视网膜病变小鼠模型，采用ES玻璃体腔内注射，应用实时荧光定量聚合酶链反应法（RTPCR）检测血管内皮生长因子（VEGF）基因在视网膜中的表达，探讨ES抑制视网膜新生血管发生的分子机制。
1材料和方法
1.1材料 新生C57BL/6小鼠54只，四川大学华西医学中心动物中心提供。ES 购自美国Calbiochem公司，总RNA提取试剂（TrizolTMRNA Isolation Reagent）和SYBR green Ⅰfluorescence dye购自美国Gibco BRL公司，RTPCR试剂盒、PCR试剂盒及DNA分子量（Marker 2000）购日本TaKaRa公司。新生C57BL/6小鼠54只，分为ES治疗组、高氧组和对照组。高氧组18只于生后7d进入有机玻璃制作的密闭氧箱，氧箱内接入100％医用湿润氧气，维持氧箱内氧气浓度为（75±5）％，5d后回到正常氧环境中。ES治疗组18只处理同高氧组建立视网膜新生血管动物模型，在出氧箱后12,36h，玻璃体腔内注射ES 1μL。对照组18只小鼠生活在正常氧环境中。
1.2方法 30g/L戊巴比妥钠（15～20mg/kg）ip处死，眼球摘除后去除眼前节、玻璃体，用虹膜恢复器将视网膜感觉层与色素上皮层分离，去除巩膜、脉络膜和视网膜色素上皮层，将视网膜感觉层在PBS液中漂洗，清除残存的玻璃体，最后将视网膜置入1.5mL EP管中，加入Trizol 1mL剧烈振荡，使视网膜全部溶解在Trizol试剂中。在4℃以 12000g离心10min，去除不溶解之物，将上清移至DEPC处理的EP管，行视网膜总RNA提取。提取的总RNA行10g/L琼脂糖凝胶电泳和紫外光分光光度计测定260,280nm的吸光度(A值)及其比值，判定其纯度（A260=1的RNA溶液每毫升约含RNA 40μg）。根据NCBI Genebank中小鼠VEGF序列行引物设计如下：上游引物：VP1: 5’TTA CTG CTG TAC CTC CAC CA3’，下游引物：VP2: 5’ACA GGA CGG CTT GAA GAT GTA3。目的基因片断为189bp。常规提取的对照组、ES作用组和给氧组小鼠视网膜总RNA置入68℃，5min，然后行冰水猝冷，采用TaKaRa公司的TwoStep RTPCR kit，在PTC2000PCR仪上进行扩增，逆转录反应条件：30℃,10min，42℃保温62min，94℃变性5min，灭活逆转录酶，4℃冷却5min，逆转录得到模板cDNA，行常规PCR，循环参数为：94℃,2min，94℃,10s，55℃,30s;72℃,1min，共35个循环，72℃ 延伸5min，4℃保温。将反应产物取8μL作15g/L琼脂糖凝胶电泳，检测扩增目的基因cDNA片断的质量。用假定初始拷贝数（x）的cDNA模板按10倍梯度进行稀释，制成标准模板系列，自每个稀释模板中取样2μL，分别加入30μL的反应体系中，行SYBR green实时荧光定量PCR。扩增条件如下：94℃,1min;93℃,10s;56℃,20s;72℃,40s，共40个循环。反应结束后，系统将采集到的每一循环反应时的各反应管的荧光强度增长指数（DRn）进行分析绘制每一反应管的扩增动力学曲线。根据动力学曲线确定每个样品管中荧光强度增加到某一特定阈值时的扩增循环数（Ct值），根据Ct值与标准模板初始拷贝的对数值作图，得到该样品的标准曲线。将逆转录得到的cDNA样品中各取2μL，在同样的反应条件下行PCR扩增。收集数据，绘制动力学曲线，测定各样品的Ct值与标准曲线进行比较，得出待测样品的相对拷贝数。
统计学分析：对荧光定量PCR所得数据取常有对数后行t检验。因所得数据均呈指数变化，平均拷贝数的计数亦采用求对数的方法。
2结果
提取的视网膜总RNA经琼脂糖凝胶电泳，结果可见28S，18S，5S 3条带，无DNA污染条带和明显降解条带，表明提取的总RNA纯度较高。提取的总RNA其A260/A280值：给氧组1.856、对照组2.100，ES治疗组2.124。琼脂糖凝胶电泳的结果可见189bp清晰亮度不同条带，说明引物设计合成无误，VEGFcDNA模板可用于定量反应。假定标准模板样品每毫升的初始拷贝数为x×105，x×104，x×103，x×102。以样品拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，拟合标准曲线。VEGF的标准曲线线性相关系数R2=0.9943（R2>0.96被认为拟合满意）。给氧组、对照组及ES治疗组样品在定量PCR仪上进行VEGF的PCR反应，绘制动力学曲线。从各样品定量PCR结果得出的各基因的相对拷贝数进行分析，数据结果以每μg RNA样品中的mRNA相对拷贝数表示。三组视网膜内VEGF的表达量(lg拷贝数/μg)（n＝18）分别为7.83±1.57，4.61±1.26和2.24±0.91。VEGF在给氧组视网膜中的表达量，同对照组比较，呈上调趋势，经统计学分析比较，差异具有显著性（P<0.05），在治疗组中的表达量同给氧组相比较，有明显的下调趋势，统计学分析表明差异具有显著性（P<0.05）。
3讨论
视网膜新生血管的形成是多步骤、多阶段的复杂过程，它是以视网膜缺血缺氧产生各种新生血管刺激因子为基础。近年来许多抗新生血管疗法的药物倍受关注[1]，但由于确切的作用机制尚不明了以及副作用较大等因素，限制其进一步的临床应用。ES是O’Reilly等在1997年从鼠血管内皮细胞瘤中分离和提纯出来的一种多肽，是目前中最有潜力的一种抗新生血管药物蛋白。VEGF是目前研究发现与视网膜新生血管相关的功能最强的血管形成促进因子，其主要作用机制可能如下：缺氧使组织释放腺苷，腺苷激活腺苷受体激动剂后促进内皮细胞合成VEGF，VEGF和受体结合后可增强一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）的合成，从而促进一氧化氮（nitric oxide，NO）的生成[2]。NO可促进血管形成，其机制可能与抑制内皮细胞蛋白激酶Cδ的活性有关。在视网膜毛细血管内皮细胞上存在大量的VEGF受体[3]，在缺氧条件下，VEGF受体表达增加，表明VEGF在与缺氧相关的视网膜新生血管化过程中起着重要的调控作用[4]。
既然VEGF为视网膜新生血管产生的必需因子，因此如能抑制VEGF的活性，就可能有效预防和抑制新生血管的生成。研究表明：应用VEGF单克隆抗体玻璃体腔内注射，可以抑制虹膜新生血管化；VEGF受体嵌合蛋白可以有效抑制氧致视网膜病变鼠视网膜新生血管的发生；反义VEGFmRNA可以和VEGFmRNA结合后抑制其翻译和表达，减少视网膜新生血管的发生率。这些实验从不同角度证明了抑制VEGF的作用是治疗眼内新生血管的一种潜在的有效途径[57]。我们采用高氧后相对缺氧的方法诱发视网膜新生血管的产生，应用ES行玻璃体腔内注射对这一过程进行干预。应用实时荧光定量PCR检测，发现氧致视网膜病变视网膜中VEGF的表达量呈现增加，而在ES作用后VEGF的表达减少。ES抑制VEGF mRNA基因表达的机制尚不清楚，我们的前期实验中应用基因芯片技术研究结果表明，ES可抑制血管内皮细胞中多种蛋白激酶的表达，因此推测ES可能通过抑制视网膜中与VEGF细胞内信号传导系统有关的蛋白激酶如蛋白激酶C、酪氨酸激酶等，从而阻断VEGF与内皮细胞膜上受体结合后的信号传导，达到抑制VEGF促新生血管生成的作用。
【参考文献】
1 OReilly MS, Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell1997;88:277285
2 Klagsburn MD, Amore PA. Vascular endothelial gowth factor and its receptors. Cytokine Growth Factor Rev1995;7:259270
3 Thieme H, Aiello LP, Takagi H, et al. Comparative analysis of vascular endothelial growth factor receptors on retinal and aortic cascualr endotheilal cells. Diabetes1995;44:98103
4 Aiello LP, Northrup JM, Keyt BA, et al. Hypoxic regulation of vascular endothelial growth factor in retinal cells. Arch Ophthalmol1995;113:15381544
5 Adamis NP, Shima DT, Tolentino MJ, et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor prevents retina ischemia associated iris neovascularization in a nonhuman primate. Arch Ophthalmol1996;114:6671
6 Aiello LP, Pierce EA, Foley ED, et al. Suppression of retinal neovascularization in vivo by inhibition of vascular endothelial growth factor(VEGF) using solute VEGFreceptor chimeric proteins. Proc Natl Acad Sci USA1995;92:1045710461
7 Robinson GS, Pierce EA, Rook SL, et al. Oligodeoxynucleotides inhibit retinal neovascularization in a murine model of proliferative retinopathy. Proc Natl Acad Sci USA1996;93:4851 4856 |
