【摘要】 目的：研究高眼压条件对大鼠视网膜神经感觉层（neurosensory retina）超微结构的影响。方法：利用自制的加压装置使大鼠眼内压升高，维持眼底缺血状态2h，再分别于恢复血液再灌注0，8，24，48h；7d处死大鼠，取出视网膜组织，电镜观察。结果：电镜下观察再灌注8h视网膜外核层、内核层细胞死亡表现出凋亡和坏死两种特征，神经纤维层水肿明显，细胞线粒体出现空泡样结构，24h有视网膜节细胞凋亡数结论：急性高眼压条件下视网膜各层细胞易损性不同，缺血再灌注不同时间各层超微结构变化不一致，凋亡不仅是视网膜节细胞的死亡形式也是其它层细胞的死亡形式薄。结论：急性高眼压条件下视网膜各层细胞易损性不同，缺血再灌注不同时间各层超微结构变化不一致，凋亡不仅是视网膜节细胞的死亡形式也是其它层细胞的死亡形式。
【关键词】 急性高眼压;视网膜神经感觉层;大鼠;超微结构
Changes of neurosensory retina ultrastructure in acute intraocular hypertension
Bin Guo, XinGuang Yang, Zhao Liu, QinHua Fan, Qian Chen, Li Cao
Foundation item:Science and Technology Projects Foundation of China(No.2004K10G7）
Department of Ophthalmology, No.81 Hospital of PLA, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China; Department of Ophthalmology, the Fourth Hospital of Xian City, Xian 710004, Shaanxi Province, China;School of Medicine, Xian Jiaotong University, Xian 710004, Shaanxi Province, China
Abstract AIM: to investigate the ultrastructural changes of neurosensory retina cells under acute intraocular hypertension condition.METHODS: the experimental ocular hypertension rat was established by selfmade pressure transmission apparatus. The ischemic neurosensory retina kept 2 hours and were taken out after the rats were killed in blood reperfusion 0，8，24，48 hours and 7 days. The specimen were fixed, sliced and observed with electron microscope. RESULTS: after 8 hours reperfusing, apoptosis occurred in outer nuclear layer, edema and vacuolelike structure in mitochondria were appeared in nerve fiber layer. Apoptosis of retinal ganglion cells reached to the peak after 24 hours reperfusion and reduced after 48 hours. On 7th day, we found atrophy of retina, which had low density of cell and few apoptosis cells. CONCLUSION: all of the anatomic layers of neurosensory retina in acute intraocular hypertension may suffer from degeneration and atrophy at different degrees with different ultrastructural changes. Not only retinal ganglion cells but cells in other layers are dead in apoptosis procedure.
KEYWORDS: acute intraocular hypertension; neurosensory retina; rats; ultrastructure
青光眼高眼压条件下视网膜病变基础与临床研究早已广泛重视，存在多种解释高眼压对视网膜病变的学说[1,2] 。国内外研究证实缺血、缺氧以及谷氨酸毒性作用下，节细胞死亡是一种特殊死亡形式——凋亡[3,4] 。但在高眼压条件下并不是仅有节细胞层受到损伤，视网膜神经感觉层所有细胞均处于缺血缺氧条件下，本实验利用电镜技术观察视网膜神经感觉层各种细胞形态变化情况。将结果报道如下。
1材料和方法
1.1材料 Wistar大鼠20只（由第四军医大学动物实验中心提供），体质量250～300g，雌雄不拘，随机分为5组动物模型制备，每组4只，以右眼为实验组，左眼为对照组。
1.2方法 所有大鼠在维持100mmHg (1mmHg=0.133kPa)高眼压2h后[5]，分别在0，8，24，48h;7d处死，取出眼球。根据帕斯卡液压定理，我们设计了实验性高眼压模型装置，血压计气囊输出管、血压计水银压力表通过橡胶管通入密闭容器内，容器另一出口接输液器，远端接4号半针头，从大鼠角膜缘斜插入前房，通过气囊打气，调整并维持血压计压力刻度在100mmHg。通过远端接口分流可同时做若干组实验。视网膜标本制备：所有大鼠断头处死。常规方法快速摘除眼球，在角膜缘处剪去角膜，置于40mL/L戊二醛中固定，固定24h后，将组织取出，小心分离晶状体，将视网膜切成长×宽为1mm×1mm，厚度为视网膜全层厚度的小块，10ml/L锇酸后固定，梯度乙醇脱水，环氧树脂Epon 812包埋，聚合后半薄切片，美蓝染色定位，超薄切片醋酸铀和枸橼酸铅双重染色后，JEM2000EX和JEM100SX透射电子显微镜观察。
2结果
2.1一般观察 在高眼压条件下动物实验眼角膜水肿混浊，结膜苍白，眼底色苍白，仅见个别视乳头处大血管。恢复正常眼压时，实验眼睫状充血，角膜水肿，部分眼前房积血，视网膜血管恢复再灌注。正常对照眼实验前后无明显变化。
2.2电镜观察结果
2.2.1正常大鼠视网膜神经感觉层超微结构 神经节细胞细胞膜、核膜完整，核染色质均匀居中，胞质内粗面内质网无明显脱颗粒及网池扩张，周围线粒体结构完整，基质电子密度均匀。神经纤维结构完整，微管微丝结构存在，无脱髓鞘现象。内核层细胞核为椭圆形，核膜完整，染色质分布正常，线粒体、核糖体、粗面内质网等细胞器未见异常。外核层细胞器形态类似外核层细胞。内丛状层外丛状层可见大量神经突触结构。光感受器细胞层锥体杆体未见异常，线粒体基质电子密度正常，未见明显空泡,视杆视锥部结构完整,核呈圆形或长圆形,核膜完整,染色质分布均匀,锥体内线粒体基质电子密度正常,膜盘排列基本正常。毛细血管无扩张充血。
2.2.2再灌注0h大鼠视网膜神经感觉层超微结构 内核层细胞出现少量髓鞘样变性结构。内核层细胞线粒体轻度肿胀。神经纤维突触连接部位损伤出现空泡样结构。内网层与外网层部分毛细血管闭塞，通透性增大，血管内皮细胞也出现线粒体肿胀等表现（图1）。节细胞膜通透性增加，突触连接部位出现空泡样结构。
2.2.3再灌注8h大鼠视网膜神经感觉层超微结构 神经节细胞层形态大致正常，部分节细胞水肿，线粒体肿胀，未见核浓缩、核碎裂和染色质边集像（图2）。外网层与内网层中神经突触水肿膨胀，线粒体空泡化（图3）。内核层细胞间隙增宽细胞胞浆浓缩，可见髓鞘样结构，有的线粒体肿胀明显（图4），基质电子密度降低，嵴变短、减少，排列紊乱，嵴间隙增宽，内质网稍扩张，部分细胞内出现一定量的溶酶体。外核层中部分细胞出现核异染色质聚集呈块状位于核膜下，核膜尚清楚，这是典型细胞凋亡的电镜结构（图5）。
2.2.4再灌注24h大鼠视网膜神经感觉层超微结构 视网膜外核层细胞出现凋亡晚期表现，染色质边集，核碎裂的细胞较多，但凋亡细胞的数量较上组明显减少。神经节细胞染色质浓缩、边集，线粒体肿胀破坏（图6），神经纤维层水肿较上组减轻。见到个别Müller细胞（图7），该细胞胞体较大，呈长梭形，一个核仁，分布在许多其它细胞周围，该细胞出现线粒体肿胀，并有空泡样变性结构。未见毛细血管扩张淤血。神经突触水肿膨胀，线粒体空泡化，嵴减少、变短，排列紊乱。
2.2.5再灌注48h大鼠视网膜神经感觉层超微结构 镜下观察结果与再灌注24h组织超微结构相似，凋亡细胞比例与前组大致相同，但节细胞中出现大量溶酶体，内质网池扩大、断裂，线粒体中出现空泡样结构，基质呈絮状致密化。外核层、内核层细胞表现与前组类似。
2.2.6再灌注7d大鼠视网膜神经感觉层超微结构 大多数细胞体积恢复正常，细胞器疏松，细胞质密度降低。节细胞层仍可见肿胀空泡化的线粒体，核糖体、内质网等细胞器数量减少，节细胞内溶酶体数量增加。内核层细胞未见核浓缩、核碎裂相（图8），但部分细胞有线粒体肿胀，空泡样结构。外核层仍可见核碎裂，光感受器细胞层膜盘不完整，排列紊乱（图9）。
3讨论
本实验利用自制加压装置建立大鼠急性高眼压模型，采用电镜技术观察高眼压对视网膜神经感觉层的超微结构影响，通过对各层细胞及有关组织形态学变化分析，进一步探讨青光眼高眼压对视网膜的损伤。
3.1急性高眼压造成神经感觉层各层损伤 该实验中再灌注0h组内网层与外网层毛细血管闭塞，血管壁通透性增加，呈现出缺血的表现，神经纤维层由于缺血缺氧水肿，突触连接部位空泡样变性，内核层、外核层细胞出现髓鞘样结构，节细胞开始表现出受损征象，在所有标本中未发现有炎症细胞浸润的证据。再灌注8h外核层内核层许多细胞开始凋亡，外网层细胞也出现线粒体、内质网的变化，部分细胞内溶酶体数量增加，节细胞可能由于耐受性较强尚未发现坏死或凋亡，但部分细胞膜通透性增加。再灌注24h部分神经节细胞出现凋亡，说明此时神经节细胞不可逆损伤开始。提示我们在青光眼急性发作后24h内，迅速降低眼压营养视神经的重要性。同时，外核层凋亡细胞数量明显减少，同时细胞密度也明显降低。由于去除高眼压条件，神经纤维层间隙恢复正常。Müller细胞也出现损伤表现。再灌注7d由于早期缺血缺氧与再灌注损伤，神经感觉层形态结构出现严重破坏，全层变薄，细胞密度降低，细胞器疏松，残留节细胞线粒体数量明显减少，空泡化。其它细胞层还可见少量细胞。
我们的研究与Panda等[6,7]实验结果部分一致，高眼压条件下视网膜全层都受到不同程度损伤，以外核层至神经节细胞层损伤最为严重，细胞死亡主要方式为凋亡。Quigley等[8,9]提出的青光眼视神经节细胞死亡也通过调亡途径。在缺血再灌注不同阶段视网膜神经感觉层各层组织损伤程度有差别，本实验表现为神经纤维层、外网层水肿，突触减少，外核层内核层细胞受损→外核层内核层细胞凋亡→节细胞凋亡，各层细胞密度减少→光感受器细胞变性→全层视网膜萎缩，部分层消失。
3.2视网膜神经感觉层损伤机制 高眼压造成视网膜神经感觉层损伤机制较多：机械压迫，缺血缺氧，轴浆运输阻滞等[1, 4, 10, 11]。我们根据实验结果提出微循环障碍是导致细胞损伤的中心因素，高眼压机械压迫视网膜中央动脉与睫状后短动脉，引起视网膜各层缺血，细胞外谷氨酸浓度增加，刺激NMDA受体，Ca2+内流，严重消耗细胞能量，激活各种钙敏感酶，造成一氧化氮、活性氧自由基增加，导致DNA断裂，细胞凋亡，如果刺激强烈的话，会引起组织坏死。各层组织对高眼压的易损性不同，受伤凋亡的顺序和程度也就不尽相同。
从超微结构的变化分析急性高眼压造成视网膜感觉层细胞死亡，为青光眼病理学机制研究提供部分形态学依据。从上述研究结果来看，对于急性青光眼的发病机制研究不应当只局限于降眼压和保护神经节细胞方面，视网膜各层细胞的保护与功能恢复才是青光眼治疗未来发展的方向。
图1透射电镜下可见毛细血管闭塞（△）、瘀血（R）、血管壁通透性增加（▲）、管壁萎缩塌陷（C），血管内皮细胞线粒体肿胀（↑） ×6000 （略）
图2节细胞线粒体肿胀（△），线粒体数量变化不大，内质网、高尔基氏体、核糖体变化不大 ×10000 （略）
图3神经突触水肿膨胀，线粒体空泡化（▲） ×10000 （略）
图4内核层线粒体肿胀（△），空泡化，内质网、高尔基氏体、核糖体变化不大 ×8000 （略）
图5外核层中的凋亡细胞 ×10000 （略）
图6视网膜神经节细胞异染色质浓缩边集（N），线粒体肿胀（▲） ×7500 （略）
图7Müller细胞（M）线粒体肿胀（▲），线粒体空泡样变化（△） ×7500 （略）
图8视网膜神经节细胞胞浆（P）中线粒体、核糖体、内质网等细胞器数量减少，线粒体肿胀空泡化（▲） ×5000 （略）
图9光感受器膜盘不完整，排列紊乱（▲） ×10000（略）
【参考文献】
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