作者：周国义，吴君舒，高前应，惠延年    作者单位：1.乐清市人民医院 眼科，浙江 乐清 325600；2.中山大学中山眼科中心，眼科学国家实验室，广东 广州 510060；3.第四军医大学西京医院眼科，陕西 西安 710032

    【摘要】  目的 研究蛋白激酶C特异性抑制剂—金丝桃素对体外培养的人视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial cells，RPE细胞）增殖的影响，探讨它防治增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy，PVR）的细胞机制。方法 用含0.5~5 μM金丝桃素血清培养人RPE 细胞，用细胞计数法、MTT比色法测定金丝桃素对RPE细胞增殖的影响。结果 细胞计数法显示金丝桃素药物作用3 d后，能抑制RPE细胞增殖，呈明显的剂量依赖性。四唑盐（tetrazolium salt）MTT比色实验显示金丝桃素对PMA诱导的RPE细胞增殖有剂量和时间依赖性抑制。结论 金丝桃素对体外培养的RPE细胞有剂量和时间依赖性抗增殖效果，具有潜在的治疗PVR前景。

    【关键词】  增生性玻璃体视网膜病变；视网膜色素上皮；细胞培养；金丝桃素；增殖

    ［Abstract］  Objective  To study the effects of hypericin on proliferation of cultured human retinal pigment epithelial cells (RPE cells) in vitro and investigate its therapeutic mechanism for proliferative vitreoretinopathy (PVR). Methods  human RPE cells were incubated in medium with various serum concentrations containing 0.5 ~5 μM hypericin and then evaluated its proliferation by means of cell counting and MTT colorimetric assay. Results  RPE cells proliferation by cell counting of viable cells was dose dependently inhibited by hypericin over a period of 3 days; Tetrazolium salt MTT colorimetric assay also showed hypericin had  dose-dependent and time-dependent inhibition against RPE cells proliferation induced by PMA. Conclusion  Hypericin has dose-dependent and time-depentent anti-proliferative effects on RPE cells in vitro， indicating it is a potential theraptic drugs for PVR.

    ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］  proliferative vitreoretinopathy; retinal pigment epithelial cells; cell culture; hypericin; proliferation

    增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy，PVR）是一种不可逆的致盲性眼病，是视网膜脱离手术最常见的失败原因［1，2］。它的基本病理改变是：视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial cells，RPE）等移行至玻璃体腔或视网膜表面，增生并形成收缩膜，导致牵拉性视网膜脱离，最终引起视力丧失。虽然手术治疗日臻完美，但一些病例仍反复发作。因此，药物辅助治疗仍是控制PVR的重要方法，如用糖皮质激素和抗代谢药等，然而这些药物存在药效较弱、毒性较大等问题，因此很有必要再寻找一些更安全、更有效的药物来防治PVR。金丝桃素（hypericin）是具有这种治疗潜能的药物之一。

    金丝桃素是从金丝桃家族中提取的多环二酮类紫色结晶颜料［3，4］。它是光动力药，用可见光照射后能产生单态氧和自由基［5，6］。在国外作为抗抑郁药应用于临床，患者有很好的耐受性并且无明显的副作用［7］。金丝桃素又是抗病毒药和蛋白激酶C （protein kinase C，PKC）的特异性抑制剂［3，8］，不仅能抑制RPE细胞的移行和Ca2+内流，还能抑制兔实验性PVR的发生发展［9~11］。本实验的主要目的是研究金丝桃素对体外培养的人RPE细胞增殖的影响，探讨它防治PVR的细胞机制。

    1  材料和方法

    1.1  常用药物的配制、贮存及使用方法

    1.1.1 佛波醇?鄄12?鄄豆蔻酰?鄄13乙酸(phorbol 12?鄄myristate 13?鄄acetate，PMA)用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解成浓度为1 μg/μl，分装，在－20℃贮存。

    1.1.2  金丝桃素（美国 Sigma Chemicals公司），用DMSO溶解，浓度为1 mg/ml，分装，在－20℃贮存，由于它是光动力药，使用时把贮存液用含1%~10％小牛血清的培养液稀释成所需浓度后，立即暴露在35瓦灯下照射1 h，然后将药物加入培养板或培养皿，移入培养箱中孵育。

    1.2  RPE细胞培养  RPE细胞培养方法同文献［11］。培养液为Dulbecco’s modified Eagle medium （DMEM），另含有2 mM L?鄄谷氨酸、100 U/ml青霉素、100 μg/ml 链霉素和1~10%灭活小牛血清。RPE细胞用0.5% 胰酶消化、传代。4~8代细胞用于实验。

    1.3  RPE细胞计数法

    1.3.1  实验分组  ?譹?訛金丝桃素组（10种浓度，浓度分别为0.5 μM、1 μM、1.5 μM、2 μM、2.5 μM、3 μM、3.5 μM、4 μM、4.5 μM和5 μM）。每组实验均设3个复孔，重复3次。?譺?訛对照组，含DMSO的DMEM培养液＋1％血清，DMSO浓度不超过0.5%(vol/vol)，已有实验证实此浓度对RPE增殖没有影响［8］。

    1.3.2  实验方法  亚融状态RPE细胞以2×104/ml接种于24孔板中，每孔1 ml(含10％血清)，孵育24 h后，吸取培养液，用PBS洗两次，加入含1%血清的10种浓度的金丝桃素，孵育3 d，细胞计数用血小板计数仪，细胞活力评估用0.4%台盼蓝染色，拒染细胞为活细胞。

    1.4  四唑盐（tetrazolium salt）MTT比色试验

    1.4.1  实验分组  ?譹?訛剂量效应关系分组　PMA组（浓度分别为1 nM、10 nM和100 nM），金丝桃素组（浓度分别为0.5 μM、1 μM、2.5 μM和5 μM），药物分别用含1％、5％和10％小牛血清的培养液稀释，对照组同上，各组均重复3次。?譺?訛时间效应关系分组　对照组、100 nM PMA组、金丝桃素组（浓度分别为0.5 μM、1 μM、2.5 μM和5 μM）、2.5 μM金丝桃素＋100 nM PMA组和5 μM金丝桃素＋100 nM PMA组。药物用含10％小牛血清的培养液稀释，加药后第1、第2、第3、第4、第5天各测量一次，共5 d。每组实验均设3个复孔，重复3次。

    1.4.2  实验方法  酶消化制成细胞悬液，调整RPE细胞密度为2×104/ml，将细胞接种于96孔板，每孔20 μl，在37 ℃、5％ CO2的CO2孵箱中培养24 h。按实验分组分别加入药物，再将培养板放入CO2孵箱中培养2~7 d后，每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）20 μl，继续孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min后进行比色测定，酶联免疫检测仪在490nm波长下读取A （absorbance）值，计算细胞抑制率。细胞抑制率＝（1－实验组A值/对照组A值）×100%。

    1.5  统计学方法  数据用x±s表示，采用美国SPSS统计软件进行One?鄄Way ANOVA分析。

    2  结果

    2.1  金丝桃素对RPE细胞计数的影响  原代培养的RPE细胞和免疫组化鉴定如图1。药物作用3d后细胞计数结果显示金丝桃素抑制RPE增殖呈明显的剂量依赖性(见图2)。第3天时，在含1％血清的培养液中，金丝桃素对RPE的半数抑制浓度（inhibition concentration 50，）为1.4 μM。金丝桃素浓度超过1.5 μM时，细胞形态开始发生变化，至2.5 μM时非常明显，失去正常六边形结构，呈梭形，有较多脱落的细胞。至5.0 μM时更加明显，很难发现贴壁细胞。

    2.2  金丝桃素对RPE细胞MTT比色结果的影响

    2.2.1  剂量效应关系  与对照组的A值（0.189）相比，PMA组（浓度分别为1 nM、10 nM和100 nM）的A值明显增加，显示PMA对RPE有明显的促增殖作用（见图3）。

    在金丝桃素（浓度分别为0.5 μM、1 μM、2.5 μM和5 μM）每个血清浓度（10％、5％和1％）组中，A值分别为0.163±0.002，0.160±0.003，0.170±0.002;0.180±0.003，0.147±0.003，0.076±0.002;0.164±0.002，0.132±0.002，0.034±0.002；0.129±0.002，  0.028±0.002，0.009±0.002；抑制率分别为13.76%，15.34%，10.05%;4.76%，22.22%，59.79%;13.23%，30.16%，82.01%;31.75%，85.19%，95.24%。显示金丝桃素对RPE细胞有明显的剂量依赖性抑制（见图4），2种血清浓度（5％和1％）金丝桃素的IC50值分别为3.4 μM和0.8 μM。

    2.2.2  时间效应关系  金丝桃素能抑制PMA导致的RPE细胞增殖，随着时间延长，金丝桃素的抑制作用逐渐增强（见表1）。

    3  讨论

    3.1  测定细胞增殖的方法  PVR是孔源性视网膜脱离手术失败的最主要原因，也是眼外伤、视网膜病变的一种结局。RPE细胞在PVR的发生发展中起重要作用，它不仅是增生膜形成和收缩的主要细胞，而且可产生趋化因子，参与增生膜的形成。本研究应用两种方法观察金丝桃素对RPE细胞增殖的影响，测得的结果相近，如图2、4和表1所示，都观察到金丝桃素对人RPE细胞有明显的剂量和时间抑制作用。活细胞计数法直接检查培养的活细胞数；MTT比色试验是一种快速、简便的颜色反应的测定，可间接反映活细胞的数量，现在其广泛用于一些生物因子活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选和细胞毒性实验等，在眼科用于测定晶状体上皮和RPE细胞等的增殖［12，13］。由于该方法灵敏度高，重复性好，无放射性污染，与细胞计数有良好的相关性，因此被广泛用于测定细胞的生长和成活，但它不能测定DNA合成程度等反映细胞增殖能力的指标［13~15］。

    3.2  金丝桃素抑制RPE增殖的机制 金丝桃素抑制细胞增殖的机制是：已知很多细胞包括RPE细胞、成纤维细胞和星形胶质细胞的增殖均由PKC部分介导［16~18］，而金丝桃素是PKC的特异性抑制剂，这就是金丝桃素抗RPE细胞增殖作用的基础。虽然PKC在介导金丝桃素效果时起关键作用，但其具体机制尚未完全明了，一般认为金丝桃素是亲脂性药物，它与PKC的调节位点结合，用与Calphostin C相似的方式修饰和灭活需要PMA结合和激活的锌硫解酶位点［5，19］。另一可能是金丝桃素通过影响PKC使RPE细胞对PVR早期信号脱敏，这些信号涉及介导血清里生长因子活动。这种PKC的抑制效果浓度与体外抑制细胞生长所需浓度一致。不同的PKC抑制剂有自己独特的来源和结构，例如H?鄄7、Staurosporine、 Calphostin C和tamoxifen都已有实验证明能抑制细胞生长［20，21］。因此抑制PKC活性可能是这些生长抑制药物的共同机制和通路。然而我们不能推断金丝桃素是否还能影响别的潜在位点，如对生长调节影响敏感的表皮生长因子受体位点［22］。

    金丝桃素在暗处仍然具有活性［6］，在光照条件下形成高活性单态氧，光照能增加抗增殖和抗病毒活性，因此光线进入眼睛后很可能进一步提高金丝桃素的活性，为临床应用创造了条件。

    总之，我们证实金丝桃素对体外培养的RPE细胞有剂量依赖性抗增殖的效果，这种作用依赖于PKC。由于金丝桃素是一个患者能良好耐受的临床使用药物，它在患者玻璃体腔内光选择性激活，导致眼内较高的局部浓度，控制与RPE细胞增生的收缩膜形成，从而具有广阔的抗PVR应用前景。