作者：王茜，刘苏    作者单位：重庆医科大学附属第二医院 眼科，重庆 400010

    【摘要】  目的 利用RNA干扰技术在视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）细胞内诱导RNA干扰(RNAi)，抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因表达，在体外细胞水平探讨RNAi对视网膜母细胞瘤治疗的可行性。方法 构建靶向VEGF基因的siRNA（VEGF-siRNA），转导入RB细胞，在瘤细胞内诱导RNAi，采用RT-PCR、细胞增殖抑制实验、Northern杂交等技术检测siRNA处理前后RB细胞增殖及VEGF基因表达变化。结果 成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体,RT-PCR发现VEGF-siRNA在RB细胞系中，能明显抑制VEGF基因的表达，抑制率为72%;对RB细胞生长抑制率达47%；VEGF基因的mRNA表达降低了78％。结论 VEGF-siRNA在体外能明显抑制了视网膜母细胞瘤细胞增殖和VEGF基因的表达。

    【关键词】  RNA干扰；视网膜母细胞瘤；血管内皮生长因子

    ［Abstract］  Objective  To investigate the feasibility of retinoblastoma (RB) gene therapy in which RNAi targeting was utilized to inhibit vascular endothelial growth factor （VEGF） gene expression in retinoblastoma cells. Methods   Small interfering RNA (siRNA) homologous to the VEGF gene (VEGF-siRNA) was recombined with a pTZU6＋1 vector, then transfected into retinoblastoma cells to induce RNAi, and then alterations in VEGF gene expression and tumor cell proliferation in both the VEGF-siRNA treated groups and control groups were detected by MTT assay, Northern Blot and RT-PCR. Results  siRNA can effectively inhibit the expression of VEGF in RB; the inhibition rate was 72%. The expression of VEGF was clearly inhibited by siRNA. The inhibition rate of cell proliferation was 47%. The mRNA level of VEGF decreased by 78％. Conclusion  VEGF-siRNA effectively inhibited VEGF gene expression and retinoblastoma cell proliferation in vitro.

     [Key words]  RNA interference; retinoblastoma; vascular endothelial growth factor

    视网膜母细胞瘤（retinoblastomea，RB）是婴幼儿常见的眼内恶性肿瘤。目前对视网膜母细胞瘤的治疗大多采用患眼眼球摘除术、放疗和化疗，尽管有较好的疗效，但同时存在患眼视功能完全丧失、影响面部发育和外观、引发第二肿瘤等不良后果。随着分子生物学及基因工程技术的迅速发展，基因治疗已成为肿瘤治疗研究的热点[1]。

    血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有多种生物学功能，与肿瘤的生长和转移密切相关。研究[2]显示，VEGF在视网膜母细胞瘤中异常高表达，对于确定RB的组织特性和生物学行为具有重要意义。然而，利用RNA干扰（RNA interference，RNAi）抑制VEGF治疗视网膜母细胞瘤的研究鲜见报道。因此，本研究依据RNA干扰技术[3]，以VEGF基因为靶点，用VEGF高表达的视网膜母细胞瘤细胞为研究对象，设计、构建、筛选靶向VEGF基因的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA),从体外细胞水平研究siRNA特异诱导VEGF基因转录后沉默、逆转癌细胞恶性表型的能力，探讨RNAi作为视网膜母细胞瘤基因治疗的可行性。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  细胞株  视网膜母细胞瘤细胞株购自湖南远泰生物技术有限公司。在含10%胎牛血清的DMEM培养液，37℃，5% CO2 孵箱中培养。

    1.1.2  质粒  质粒pTZU6+1，内含人U6启动子Ⅲ，由美国University of Michigan Dr. David Engelke教授惠赠。

    1.1.3  试剂  限制性内切酶XbaI、SalI、Hind III和EcoRI购自Takara公司，总RNA提取试剂、转染试剂LipofectamineTM 2000购自Invitrogen公司；PCR试剂购自Takara公司；VEGF抗体购自博士德公司；siRNA-VEGF转录模板由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；α-32P-dATP购于北京福瑞生物技术工程公司，采用Amersham公司随机引物标记试剂盒Megaprime DNA labeling systems 进行DNA探针标记，尼龙膜为德国Roche公司的HybondTM N+尼龙膜。

    1.2  方法

    1.2.1  VEGF基因shRNA表达载体的构建  VEGF的siRNA转录模板选择参照E-RNAi网上（http://e-rnai.dkfz.de/）提供的服务完成。分别是：siRNA-V1：TGAAGTTCATGGATGTCTATC和siRNA-V2:ACATCACCATGCAGATTATGC，分别位于VEGF基因的122~142和302~322位。将其设计成能在体内转录成反向互补且以TTCG为茎环的小发夹样RNA。先人工合成寡核苷酸DNA片段，在含200 mM NaCl的退火缓冲液中进行退火，连接到pTZU6+1载体上，构建成靶向VEGF基因的pShRNA-V1和pShRNA-V2，经酶切鉴定后，再测序证实。以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的shRNA表达载体（pShRNA-GFP）作为无关干扰对照，siRNA-GFP序列为GCTGACCCTGAAGTTCATC。

    1.2.2  质粒转染  采用LipofectamineTM 2000脂质体转染法。转染前一天，换取无抗生素培养液后调整RB细胞浓度为2×105个/ml，以2 ml/孔接种于6孔培养板中培养。待细胞增至90%~95%时，将质粒-脂质体复合物转染至细胞中（质粒∶脂质体=1∶4）， 在37℃、5% CO2、无血清、无抗生素的培养液培养16~18 h后换G418选择培养液，继续培养72～96 h后检测各指标。pShRNA-V1和pShRNA-V2转染为实验组；pTZU6+1空载体转染为阴性对照组；pShRNA-GFP转染为无关干扰对照组。

    1.2.3  细胞总RNA的提取  胰酶消化收集细胞，细胞沉淀用10 ml PBS漂洗1次，以后的操作按试剂盒说明进行，产物用50 μl无RNA酶的水溶解，于-80℃中保存，避免反复冻融。

    1.2.4  VEGF基因mRNA的RT-PCR扩增及半定量RT-PCR检测  其引物如下：VEGF的引物为，上游：5'-CTACCTCCACCATGCCAAGT-3'，下游：5'-AAATGCTTTCTCCGCTCTGA-3'，扩增产物长度为411bp，用一步法RT-PCR将其扩增出，退火温度为55℃，反应条件为：逆转录50℃ 30 min，95℃ 10 min，进入25次循环（94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min），72℃ 10 min后结束，通过琼脂糖凝胶电泳，观察RT-PCR产物大小与预期相符后，将产物装入pGEM-T载体上，再测序证实扩增产物为所需的VEGF基因片段。半定量检测时，以hGAPDH扩增产物为内参，hGAPDH的上游引物为5'-GGCTCTCCAGAACATCAT-3'，下游引物为5'-CACCTGGTGCTCAGTGTA-3'，扩增产物为240 bp (678~918 bp))。在一个总体积为25 μl的反应体系中，同时加入VEGF和GAPDH两对引物，总RNA模板加1 μl，RT-PCR反应条件同上，取5 μl产物进行电泳，成像后用GeneTools软件进行定量分析。

    1.2.5  MTT实验  收集对数生长期的RB细胞，接种96孔板，细胞终密度为2×104/孔，每个样本设3个平行孔，每孔总体系200 μl，试剂空白以无血清DMEM培养液补足。于37℃，5% CO2 孵箱中培养24 h，在每孔中加入四甲基偶氮唑蓝（MTT，浓度为0.5 mg/ml），继续培养4 h，弃上清，加入二甲基亚砜200 μl，振荡5 min，用酶标仪（570 nm）读取A值。细胞增殖抑制率=（1－实验组平均A值/对照组平均A值）×100%。

    1.2.6  Northern杂交检测VEGF mRNA表达变化  25 μg RB细胞总RNA上样电泳于1.2%的甲醛变性凝胶中，再过夜转移至尼龙膜上，80℃干烤2 h固定后，42℃杂交过夜，探针为α-32P-dATP标记的VEGF片段，标记方法按试剂盒操作说明进行。尼龙膜经漂洗后，于-80℃曝光48~72 h。以凝胶电泳中总RNA的量作为内参，来恒定细胞总数。

    1.2.7  统计学方法  所有检测实验均重复3次，数据以x±s表示，使用SPPSS 11.5统计软件，对数据采用t检验。

    2  结果

    2.1  重组质粒的鉴定   pShRNA-V1和pShRNA-V2质粒经HindIII和EcoRI双酶切，同时做pTZU6+1空载体双酶切对照。2%琼脂糖电泳，pTZU6+1空载经双酶切后呈两条带，分别为2.8 kb的载体片段和352 bp的小片段；而pShRNA-V1和 pShRNA-V2则为2.8 kb的载体片段和395 bp的目的片段（见图1）。测序结果证实插入片断大小和序列均正确。

    2.2  VEGF基因mRNA的RT-PCR扩增产物电泳

    如图2所示，扩增产物电泳的位置与预期411 bp相符。将其装入T载体上，测序证实为所需的VEGF基因片段。

    2.3  在视网膜母细胞瘤细胞中RNA干扰抑制VEGF mRNA表达的效率

    如图3所示，在视网膜母细胞瘤细胞中，与转染pTZU6+1(1)相比，pShRNA-V1和V2均可以明显抑制VEGF基因的表达，GeneTools软件定量分析显示，其抑制率为0.713±0.021，差异有非常显著性（P<0.01）。

    2.4  细胞增殖抑制实验  pShRNA-V1和 pShRNA-V2处理组中，RB细胞平均增殖抑制率最高(在第3天时)，可分别达到0.462±0.014和0.409±0.027，明显高于pTZU6+1空载体阴性对照组(0.082±0.0031)和pShRNA-GFP无关干扰对照组（0.117±0.0043）(见图4)。

    2.5  Northern杂交检测VEGF mRNA表达受抑情况  与GFP无关序列对照组(1.050±0.021)、pTZU6+1阴性对照组(1)相比，pShRNA-V1和 pShRNA-V2处理组中VEGF mRNA表达明显受抑。通过内参总RNA进行定量分析，其抑制率分别为0.719±0.047和0.869±0.063。与对照组比较，pShRNA-V1和 pShRNA-V2处理组中VEGF mRNA表达变化差异具有显著性(P<0.05)（见图5）。

    3  讨论

    视网膜母细胞瘤是最常见的儿童眼内恶性肿瘤,全球每年新发病例约5000例。目前国内的主要治疗方法是行患眼眼球摘除和眼眶内容物剜出，保守治疗进行得很少，患儿的5年生存率仅50%。而发达国家根据RB的分组情况尽可能进行保守治疗，其5年生存率可达95%。国外学者在经过大量的临床试验后，已将对RB的治疗目标定为：在保存患者生命的首要前提下，合理采用非手术治疗，尽量保存眼球，保存有用视力，提高患者的生活质量[4]。在众多非手术治疗中，基因治疗无疑是最具前景的抗肿瘤策略之一。

    恶性肿瘤的生长和转移必须依赖于丰富的营养供给，组织中血管的生成为营养物质和氧气进入肿瘤组织、把代谢产物运出组织细胞外和为肿瘤细胞迁移至靶器官奠定了重要的基础条件，因此，肿瘤血管生成在恶性肿瘤的发生、发展、侵袭和转移中起重要作用。目前，研究发现与肿瘤血管生成有关的因子有30余种，如血管内皮生长因子、血管抑素、内皮抑素、纤维蛋白生长因子等，其中血管内皮生长因子及其受体在肿瘤新生血管生成过程中起着至关重要的作用[5]。研究表明，VEGF具有促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性，促进血管支持物的生成，抑制肿瘤细胞凋亡的功能。由于VEGF的功能强大，故已成为肿瘤基因治疗的靶点。另外，现已发现VEGF的高表达还与类风湿性关节炎和眼底血管病变相关，且已有研究通过抗VEGF表达来治疗这些疾病，并取得了显著的效果。

    RNA干扰作为一种新型的生物技术已广泛应用于多领域和多学科的研究中，并取得了显著的效果。已有研究通过RNA干扰技术，抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜上皮细胞的VEGF基因的表达[6~8]，发现VEGF的抑制可以使肿瘤细胞的增殖能力减弱，肿瘤内新生血管减少，故认为针对VEGF基因进行的RNA干扰，是一种有效的抗肿瘤方式。

    在本实验中，我们发现靶向VEGF的siRNA能在视网膜母细胞瘤细胞中有效地诱导RNAi，明显抑制了视网膜母细胞瘤细胞的生长；同时，pShRNA-V1和 pShRNA-V2明显下调了VEGF mRNA的表达。说明靶向VEGF的siRNA选择合理，利用RNAi抑制VEGF基因表达以治疗视网膜母细胞瘤的思路可行。因此，本研究将为下一步探讨VEGF基因受抑时，肿瘤细胞病理和生理变化的研究提供参考。

    【参考文献】

    [1] 李涛，张虹，王骞，等. HSV-tk/GCV自杀基因系统对视网膜母细胞瘤的体外抗肿瘤效应[J]. 华中科技大学学报(医学版)，2003，10（5）:533-537.

    [2] 姜影，杜金荣，张艳梅.视网膜母细胞瘤VEGF、PCNA表达研究[J]. 肿瘤防治研究，2004，31（5）:255-256.

    [3] Sui G, Soohoo C, Affar el B, et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(8)：5515-5520.

    [4] 宋爽,张军军. 视网膜母细胞瘤的治疗进展[J]. 四川医学，2004，25（5）：597-598.

    [5] Onen IH, Konac E, Eroglu M, et al. No association between polymorphism in the vascular endothelial growth factor gene at position-460 and sporadic prostate cancer in the Turkish population[J]. Mol Biol Rep，2007，11:[Epub ahead of print]. [PMID：17216542]

    [6] Mulkeen AL，Silva T，Yoo PS，et al. Short interfering RNA-mediated gene silencing of vascular endothelial growth factor：effects on cellular proliferation in colon cancer cells[J]. Arch Surg，2006，141(4):367-374.

    [7] Wannenes F, Ciafre SA, Niola F, et al. Vector-based RNA interference against vascular endothelial growth factor-A significantly limits vascularization and growth of prostate cancer in vivo[J]. Cancer Gene Ther，2005,12(12):926-934.

    [8] Murata M, Takanami T, Shimizu S, et al. Inhibition of ocular angiogenesis by diced small interfering RNAs (siRNAs) specific to vascular endothelial growth factor (VEGF) [J].Curr Eye Res， 2006，31(2):171-180.