【摘要】 观察重组腺病毒介导的色素上皮衍生因子(AdPEDF)对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用及机制。
方法：选用健康大鼠96只，随机分为正常组、缺血再灌注组、缺血再灌注＋AdCMV组，缺血再灌注+AdPEDF组，以前房加压的方法制备大鼠视网膜缺血再灌注模型，缺血再灌注＋AdCMV组，缺血再灌注+AdPEDF组分别玻璃体腔注射AdCMV或AdPEDF1μL(滴度3.8×109/PFU)，每组按照时间点12,24,72,168h,为4亚组,光学显微镜观察视网膜组织切片情况，并测量视网膜内层厚度及神经节细胞层神经节细胞数量。以TUNEL方法观察大鼠视网膜神经节细胞凋亡情况。
结果：AdPEDF组视网膜内层厚度均超过缺血组及缺血+AdCMV组，AdPEDF组神经节细胞数目多于缺血组及AdCMV组，AdPEDF组视网膜神经节细胞凋亡细胞少于缺血组及AdCMV组，凋亡程度减轻，上述差异均具有显著性（P<0.05）。
结论：腺病毒介导的色素上皮衍生因子玻璃体腔注射能够恢复大鼠视网膜缺血再灌注损伤所致的视网膜内层厚度降低，神经节细胞密度减少，具有保护作用。
【关键词】 视网膜
0引言
视网膜缺血再灌注损伤（retina ischemic reperfusion,RIR）是指视网膜组织缺血、缺氧后，恢复血液循环所致的损伤，常见于青光眼、视网膜中央动脉栓塞、视网膜中央静脉阻塞、糖尿病性视网膜病变等疾病，由于神经组织不能再生的特点，上述疾病经常导致视网膜形态和功能的明显改变，是目前眼科学者普遍关注的热点之一。近来一些研究表明某些神经生长因子能够促进神经节细胞的存活和轴突再生，色素上皮衍生因子（ pigment epithelium derived factor，PEDF）[1]是在培养的人胎儿视网膜色素上皮细胞的基质中发现的一种分子质量为50kDa的蛋白质,是一种内源性保护因子，具有神经保护和抗新生血管双重作用。对视网膜的机械损伤、光损伤和缺血性损伤等具有促进修复的作用[24]。我们利用重组腺病毒介导的色素上皮衍生因子（AdPEDF），以前房加压的方法建立大鼠视网膜缺血再灌注模型，将AdPEDF以玻璃体腔注射的方式转染视网膜组织，观察PEDF基因治疗对大鼠视网膜缺血再灌注损伤形态学的影响，为临床运用提供实验依据。
1对象和方法
1.1对象
选用健康成年Wistar大鼠（沈阳军区总医院实验动物中心提供），体质量180～220g，雌雄不限。手术显微镜（美国蔡司）、生物显微镜、日本Nikon自动脱水机、切片机、眼科显微器械、微量注射器（上海医用激光仪器厂）、对照腺病毒AdCMV(东方肝胆外科实验室)、单克隆鼠抗体PEDF (美国Chemicon公司)、羊抗鼠多克隆抗体、细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司)。
1.2方法
视网膜缺血再灌注损伤模型制作采用前房加压方法[5]，水合氯醛（300mg/kg）ip麻醉大鼠。地卡因眼液滴眼，复方托吡卡胺眼液充分散瞳。4.5号输液针头自大鼠颞侧角膜缘穿刺入前房固定，升高灌注瓶高度至与动物眼垂直距离为150cm处，使大鼠眼压维持在110mmHg（1mmHg=0.133kPa）。观察当输液瓶内的液体无向眼内滴注，球结膜及虹膜迅速苍白，间接检眼镜观察视网膜苍白水肿，证实引起视网膜缺血。灌注加压持续60min后，拔出穿刺针头，虹膜及球结膜颜色迅速恢复正常，检眼镜检查视网膜呈橘红色，视网膜动脉搏动，证实再灌注发生，迪可罗眼膏涂眼预防感染。选择大鼠96只，随机分为正常组（简称N组）、缺血再灌注组（简称R组）、缺血再灌注＋AdCMV组（简称C组），缺血再灌注+AdPEDF组（简称P组），每组24只。正常组不进行任何处理，缺血再灌注组、缺血再灌注＋AdCMV组，缺血再灌注+AdPEDF组均首先制备视网膜缺血再灌注模型，缺血再灌注+AdPEDF组：玻璃体腔注射AdPEDF1μL(滴度3.8×109/PFU)，缺血再灌注＋AdCMV组：玻璃体腔注射AdCMV1μL，每组按照时间点12,24,72,168h分为4亚组，每亚组分别为6只大鼠。
1.2.1视网膜病变
将各组大鼠分别在不同时间点处死后，即刻摘除眼球，固定、脱水、透明、包埋。将包埋好的眼球标本沿视神经矢状轴前后方位视网膜全层切片（厚度5μm）。HE染色，中性树胶封片。视网膜内层厚度测量：应用图像分析软件系统测量距视盘边缘100μm长度内视网膜内层厚度(指视网膜内界膜到外丛状层内缘的距离),每只眼球取3张切片进行分析。神经节细胞计数：同样方法在视网膜切片上计数100μm内神经节细胞层神经节细胞数量，每只眼球取3张切片进行分析。
1.2.2凋亡指数检查
将各组大鼠在不同时间点处死后，即刻摘除眼球。常规石蜡切片脱蜡,酒精梯度水化,H2O2室温10min,复合消化液室温5min,末端脱氧核酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl ransferase,TdT)反应液20μL,37℃湿盒孵育2h,生物素化抗地高辛抗体50μL，37℃湿盒反应30min,SABC法染色,DAB显色,苏木素轻度复染,脱水,透明,封片。以细胞核呈棕色染色为阳性细胞。放大率400倍时随机对10个视野进行观察，应用图像分析系统对结果进行分析，计算凋亡指数(AI),即AI=凋亡细胞数/细胞总数×100%。
统计学处理：应用SPSS12.0软件统计分析，所有数据以均数±标准差表示,不同时间点作单因素方差分析并进行两两比较，两两比较选用q检验，各时间点组间比较选用单因素方差分析, P<0.05表示差异有显著性的意义。
2结果
2.1光学显微镜组织学观察
缺血再灌注损伤12h后，视网膜内核层排列紊乱、轻度变薄，神经纤维层扁平，神经节细胞排列较稀疏,数目减少，细胞变性。缺血再灌注损伤24h后，视网膜水肿完全消退，内层变薄，神经节细胞可见空泡变性，胞浆染色变淡，着色不均，细胞核增大，染色质变浅，分布不均，可见较长片段的神经节细胞缺失。缺血再灌注损伤72h后神经节细胞数目减少，内层视网膜多见固缩核，神经纤维层厚度变薄，节细胞大部分仍水肿、空泡变性，小部分固缩坏死，RGC计数减少。缺血再灌注168h后内层视网膜萎缩变薄,视网膜神经节细胞减少,明显肿胀,内、外核层排列紊乱。神经纤维层变薄，内核层细胞排列紊乱(图1A,B)。AdCMV组的视网膜内5层的组织学变化与缺血再灌注组类似。AdPEDF治疗组12h视网膜内核层、内丛状层明显增厚，内核层及神经节细胞层细胞排列稍乱，偶见核固缩现象。神经节细胞空泡变性、染色质边缘聚集现象较少。AdPEDF治疗组24h：视网膜内层明显增厚,视网膜神经节细胞保存较好,内、外核层较稠密、整齐。ADPEDF治疗组72h视网膜内层明显较厚,有较多的神经节细胞存在，内、外核层较稠密、整齐（图1C,D）。
2.2视网膜内层厚度及神经节细胞密度
正常组大鼠视网膜内层厚度为101.9±3.9μm,RIR后12h视网膜内层厚度减少为67.8±4.4μm，24h达到最低值为59.1±1.7μm，直至168h仍维持在较低水平，在各时间点与正常组相比均有统计学差异，说明缺血再灌注损伤后视网膜内层厚度降低。AdCMV组变化趋势与缺血组基本相同，具体数值与缺血组无统计学差异。AdPEDF治疗组12h视网膜内层厚度为82.9±2.0μm，24h为80.1±2.2μm，各时间段AdPEDF组视网膜内层厚度均超过缺血组及缺血+AdCMV组（P<0.05）,差异具有显著性（表1）。各时间段AdPEDF组RGC数目变化与视网膜内层厚度变化趋势类似， AdPEDF治疗组在各时间段RGC数目多于缺血组及AdCMV组，差异有显著意义（表2）。表1大鼠缺血再灌注治疗后视网膜内层厚度比较(略）表2大鼠缺血再灌注治疗后视网膜神经节细胞数量比较(略）
2.3凋亡指数
在12h时和24h计数了各组凋亡指数，正常大鼠视网膜TUNEL染色阴性。再灌注12h后，即可以见到视网膜神经节细胞的凋亡(细胞核呈现棕黄色)，可见内核层有凋亡阳性细胞。再灌注24h神经节细胞层和内核层可见凋亡细胞明显增加，达到了高峰，并且在外核层可见凋亡细胞（图2A）。AdCMV组变化趋势与缺血组基本类似。AdPEDF治疗组12h可见视网膜神经节细胞凋亡细胞减少，凋亡程度减轻,AdPEDF治疗组24h凋亡细胞明显减少，凋亡程度减轻(图2B)。使用AdPEDF后，细胞凋亡指数下降，具有统计学差异(表3)。表3大鼠缺血再灌注治疗后TUNEL凋亡指数(略）
3讨论
视网膜缺血再灌注损伤在眼科较为常见，例如视网膜中央动脉栓塞、静脉阻塞、缺血性视神经病变、青光眼、糖尿病视网膜病变，早产儿视网膜病变，以及影响视网膜血流的眼科手术等。视网膜缺血再灌注损伤的发病机制及临床治疗一直为眼科学者关注。近来一些研究表明某些神经生长因子能够促进神经节细胞的存活和轴突再生，其中PEDF以其独有的双重作用即神经保护和抗新生血管作用而受到日益关注。PEDF是在培养的人胎儿视网膜色素上皮细胞的基质中发现的一种分子质量为50kDa的蛋白质,是一种内源性保护因子，主要由视网膜色素上皮细胞所合成和分泌，能够影响视网膜的分化发育和成熟,促进视网膜损伤修复。其组织相容性较好,耐药性和排斥反应少,在眼科临床应用中具有良好前景，然而PEDF蛋白和其它细胞因子一样，在体内不稳定，半衰期短，需要多次大量用药，才能维持局部较高的药物浓度，达到较好的治疗效果[6,7]。目前通过基因治疗的方法可使外源基因转染到体内表达，在一段时间内持续提供高浓度的蛋白药物治疗，具有一定的优越性。
许多研究证明,大鼠视网膜缺血再灌注损伤中,视网膜神经元的丢失和死亡主要发生在视网膜神经节细胞层(ganglion cell layer,GCL)和内核层(inner nuclear layer,INL)，大鼠视网膜缺血再灌注时，视网膜内层萎缩变薄，RGCs大量坏死。以往研究发现缺血再灌注损伤后PEDF基因表达上调,内源性PEDF升高以应答视网膜神经节细胞轴索损伤,保护视网膜神经节细胞，但此反应仅限于早期且表达量不足,我们利用重组腺病毒介导的色素上皮衍生因子（AdPEDF），以前房加压的方法建立大鼠视网膜缺血再灌注模型，将AdPEDF以玻璃体腔注射的方式转染视网膜组织，视网膜内层厚度较缺血组及缺血+AdCMV明显增加，RGC密度增高。提示外源性PEDF能保护视神经损伤后的视网膜神经节细胞损伤,促进损伤修复。这说明AdPEDF能够减轻视网膜缺血再灌注损伤的组织学改变[8]。
近年来研究认为，视网膜缺血、缺氧后，导致靶源性神经营养因子的供给中断，同时产生较多的兴奋性毒素，并激活了某些诱导凋亡的基因，出现大量钙离子内流，钙离子超载，通过胞内信号转导，激发一系列级联式反应，最终导致DNA断裂，细胞发生变性凋亡，从而引起视网膜神经节细胞和轴突死亡[9,10]。大量实验表明，缺血再灌注损伤在视网膜神经节细胞层及内核层可见凋亡细胞,我们在本实验中用TUNEL法观察大鼠视网膜缺血再灌注损伤12h后神经节细胞层和内核层可见凋亡细胞，24h凋亡细胞达到高峰。说明视网膜缺血再灌注引起的损伤可导致视网膜细胞凋亡。使用AdPEDF后凋亡细胞明显减少，说明AdPEDF能够抑制细胞凋亡的发生，从而发挥其神经保护作用。综上所述，腺病毒介导的色素上皮衍生因子玻璃体腔注射能够恢复大鼠视网膜缺血再灌注损伤所致的视网膜内层厚度降低，神经节细胞密度减少，具有神经保护作用。其作用机制可能与减少神经节细胞凋亡有关。
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