2  结果

    2.1  F-VEP潜伏期  A组和C组的潜伏期在视神经损伤后表现为先延长后缩短的趋势，即从伤后第7天潜伏期开始有所缩短，到第21天分别降为（65.46±6.97）ms和（72.06±6.57）ms。B组和D组的潜伏期在伤后则表现为逐渐延长的趋势，到伤后第21天分别延长为（129.21±10.13）ms和（130.41±11.12）ms。N组潜伏期则在每个时间点基本一致，没有显著变化。经统计学分析，A组潜伏期在4 d组继续延长，至伤后7 d组、10 d组、14 d组可见潜伏期逐渐缩短，至21 d组逐渐稳定，与B组比较，4 d组、7 d组、10 d组、14 d组以及21 d组的差异均有显著统计学意义（P<0.05）。同样，C组与D组比较，4 d组、7 d组、10 d组、14 d组以及21 d组的差异均有统计学意义（P<0.05）。其中，A组10 d组与14 d组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；14 d组与21 d组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。C组10 d组与14 d组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。A组与C组比较，21 d组差异有统计学意义（P<0.05）。N组潜伏期与其他各组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。各组潜伏期数据见表1，F-VEP图像见图1~图4。

    2.2  F-VEP振幅  F-VEP振幅和潜伏期有着相似的表现。不同的是：A组与B组、C组与D组在伤后第4天比较，差异没有统计学意义（P>0.05），从伤后第7天开始，以后各组差异均有统计学意义（P<0.05）。各组振幅数据见表2，F-VEP图像见图1~图4。

    2.3  视神经MRI图像结果  损伤前，兔视神经清晰可见，呈中等信号，眶内结构规整。损伤后第1天，视神经损伤区呈椭圆形或球形肿胀增粗，边界不清，眶内结构紊乱。损伤后第4天各组与第1天比较差别不大。B组和D组至第14天以及第21天仍可见视神经周围信号增高，视神经形态结构异常，但絮乱的眶内结构趋向稳定。而A组和C组则在第7天可见粗大的视神经开始消退，水肿也逐渐吸收，至第14天以及第21天视神经边界清晰，视神经形态结构基本正常，和B组、D组比较差别也最为明显。见图5~图8。

    2.4  TUNEL染色以及RGCs定量分析  凋亡细胞呈胞核染色，棕黄色颗粒，部分由于核固缩而失去正常形态，并可见凋亡小体。B组和D组：损伤后第1天可见凋亡细胞，第4天逐渐增多，至第7天达高峰，第14以及第21天持续减少。A组和C组：伤后第1天也可见少量凋亡细胞，第4～第10天有少量增多，第14天以及第21天仅见极少数凋亡细胞。空白对照组未见阳性细胞。见图9~图12。

    各组伤后不同时间点的RGC细胞凋亡率见表3。除伤后第1天外，A组与B组、C组与D组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。A、C两组的第14天组间比较，差异有统计学意义（P<0.05），第21天组间也有统计学意义。而A组与C组两组中第14、第21天组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。

    3  讨论

    视神经损伤后视网膜神经节细胞的损伤机制主要包括RGCs的死亡和凋亡，多种离子、细胞因子及毒素因子参与其发生、发展过程，其中caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路[3-4]。Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK是选择性的caspase抑制剂，能够通过抑制caspase-3的活化而起到抗细胞凋亡作用。本实验采用闪光视觉诱发电位（F-VEP）、眼眶核磁共振（MRI）以及TUNEL染色，来观察外伤性视神经损伤后caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK的神经保护机制。

    3.1  F-VEP检查结果分析  F-VEP能够很敏感地反映视神经损伤的程度以及恢复过程，是体现视神经状态的客观功能指标之一。其中P-100主要反映视神经传导机能，波幅主要反映黄斑部的视网膜感受机能[5]。本实验结果可见，B组和D组视神经损伤后第1天，主波潜伏期逐渐延长，第10天趋于稳定，伤后振幅逐渐降低，表明视神经损伤后神经传导速度减慢和视觉中枢反应强度减弱都十分明显。Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK注射后第4天起，损伤的视神经在神经传导机能和视网膜感受机能方面有所恢复，在第10~第14天达到高峰，推测在伤后第10~第14天，存活的RGCs通过caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK的作用，在功能上得以明显恢复，受损伤的轴突也有相当程度的生长。从实验结果可见，A、C两组在组内比较，14 d组与21 d组差异无统计学意义（P>0.05），可见这种保护作用可以持续到第21天，也说明球周注射与玻璃体腔注射起着相似的效果。但A组与C组的21 d组比较有统计学意义（P<0.05），说明与球周注射相比，玻璃体腔注射作用更加持久，可能与球周注射方式比玻璃体腔注射方式容易扩散，不能在局部保持高浓度有关[6]。

    3.2  MRI图像分析  损伤后第1天，视神经损伤区呈椭圆形或球形肿胀增粗，边界不清，眶内结构紊乱。B组和D组至第14天以及第21天时仍可见视神经周围信号增高，视神经形态结构异常；而A组和C组第7天后则可见粗大的视神经开始消退，水肿也逐渐吸收，至第14天以及第21天视神经边界清晰，视神经形态结构基本正常，说明注射caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK后第7天左右开始表现出修复视神经的作用，至第14天以及第21天，实验组与对照组的这种差别更为明显，可见caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK在减轻视神经损伤以及促进视神经的修复方面都有重要的作用。

    3.3  TUNEL染色以及RGCs定量分析  A组和C组在伤后第1天可见少量凋亡细胞，第4～第10天仅有少量增多，而对照组凋亡细胞则明显增多，可见caspase-3抑制剂能够抑制节细胞的凋亡[7]。另外，从结果中可见，caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK能通过阻断caspase-3作用而使部分受损的RGCs存活[8]，并且这种作用在第4天后起效，第7天至第10天达高峰，可稳定到第21天。而B、D组在伤后第21天RGCs数目减少十分明显（P<0.05）。此外，A组中伤后第14天组以及第21天组与C组中相应时间点的组别比较有统计学意义（P<0.05），也说明与球周注射相比，玻璃体腔注射作用更加持久。

    综上所述，caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK能有效地抑制视神经损伤后神经节细胞的凋亡，在一定程度上促进视神经的修复[9]。但是，节细胞的凋亡是多种因子共同调节的结果，caspase-3抑制剂并不能完全抑制节细胞的凋亡，这可能与还存在非caspase依赖的凋亡途径有关[10]。同时，caspase-3抑制剂的持续作用时间以及因caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK而存活的节细胞能生存多久，也有待进一步研究[11]。

    【参考文献】

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    [2] Ferrer I， Planas AM. Signaling of cell death and cell survival following focal cerebral ischemia： life and death struggle in the penumbra[J]. Neuropathol Exp Neurol，2003，62（4）：329-339.

    [3] Namura S， Zhu J， Fink K， et al. Activation and cleavage of caspase-3 in apoptosis induced by experimental cerebral ischemia[J]. J Neurosci，1998，18（10）：3659-3668.

    [4] 周咏东，严密，张军军． 碱性成纤维细胞生长因子对可见光诱导的人视网膜色素上皮细胞凋亡的影响[J]． 中华眼底病杂志，2003，19(1)：24-28.

    [5] 万文萃． 中国白兔视神经损伤后的闪光视觉诱发电位的实验研究[J]． 临床和实验医学杂志，2006，5(10)：1484-1485.

    [6] 薛飞，曹云莉，李泽卿，等． 兔外伤性视神经损伤后不同时期减压的视功能动态检测[J]． 医学研究生学报，2008，21(3)：263-266.

    [7] 彭玉豪，李和平，Clark AF． 青光眼的视神经保护策略[J]． 中华眼科杂志，2004，40(11)：783-787.

    [8] Chaudhary P， Ahmed F， Quebada P， et al． Caspase inhibitors　block the retinal ganglion cell death following optic nerve transection[J]． Mol Brain Res，1999，67(1)：36-45．

    [9] Bode C， Wolfrum U． Caspase-3 inhibitor reduces apototic photoreceptor cell death during inherited retinal degeneration in tubby mice[J]． Molecular Vision，2003，9（1）：144-150．

    [10] Kirsty L， Arun M， Alan R. Caspase-independent retinal ganglion cell death after target ablation in the neonatal rat[J]． Eur J Neurosci，2005，21(1)：33-45．

    [11] Kermer P， Kl?觟cker N， Labes M， et al． Inhibition of CPP32-like proteases rescues axotomized retinal　ganglion cells from secondary cell death in vivo[J]． J Neurosci，1998，18(12)：4656-4662．

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