作者：高磊 高玫蕊
【关键词】 牛磺酸;视网膜; 缺血再灌注
【Abstract】 Objective To investigate the effect of taurine on retina in rats with the damage of retinal ischemia-reperfusion and its mechanism ．Methods 120 Wistar rats were divided randomly into 3 groups: control group, ischemia group,protective group．Increasing the intraocular pressure to 110 mm Hg for 60 minutes with anterior chambers infused liquid induced the models of retinal ischemia-reperfusion of rats,3 days,30 minutes before retinal ischemia, the rats in the protective group received a intraperitoneal injection of taurine at dose of 100 mg/kg twice a day for 3 days and the rats in the control group received a intraperitoneal injection of sodium chloride at same dose ,at 30 minutes,12 hours,24 hours,48 hours，72 hours after ischemia- reperfusion, the effect of taurine on retinal degeneration was assessed by measuring the level of SOD,MDA，NO and the thickness of the inner retinal layers(MTIRL) ．Results The level of SOD was decreased,but those of MDA and NO both were increased after ischemia-reperfusion retina of rats．the changes of MDA and NO were blocked by taurine．but the effect of taurine to SOD was not confirmed. Conclusion Taurine can protect the retine from ischemia-reperfusion injury.
【Key words】 Taurine; Retinal; Ischemia-reperfusion
视网膜缺血再灌注损伤是眼科临床常见的一种病理过程,如视网膜中央动脉栓塞、缺血性视神经病变、青光眼等。 视网膜组织主要成分为神经组织,它的中央动脉为终末动脉,因此视网膜缺血和循环障碍,可以导致视网膜的严重损伤。牛磺酸(Taurine,化学名称2-氨基乙磺酸,简称Tau)是一种含硫的氨基酸, 占大鼠视网膜中氨基酸总量的50%，主要存在于神经元和神经胶质细胞,是光感受器发育的重要营养因子[1]。本研究首次观察了牛磺酸对视网膜缺血再灌注损伤后视网膜SOD、MDA和NO水平及平均视网膜内层厚度的变化。
1 材料与方法
1．1 仪器与试剂 台式离心机（Heraeus,德国）；分光光度计（上海）；牛磺酸粉剂(sigmma 公司，广东)。SDA，MDA及 NO分析试剂盒（南京建成生物医学研究所）。其他均为国产分析纯。
1．2 实验动物及分组 取在正常昼夜周期环境中饲养的SD大鼠120只，雌雄不限，体质量180～220 g，由兰州大学动物实验中心提供。随机分为3组:对照组、缺血组、保护组,牛磺酸保护组于手术前,连续3 d，2次/d，腹腔注射牛磺酸,剂量为100 mg/kg每只,牛磺酸用生理盐水新鲜配制。于手术前10 min加注1次。缺血组和对照组用等量生理盐水腹腔注射,方法同保护组。
1．3 动物模型 参照文献[2],大鼠经腹腔注射3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)全身麻醉后,双眼局部滴1%地卡因,将大鼠固定鼠板上。散瞳后前房内插入5号灌注针头,针头连于生理盐水瓶,使盐水位于150 cm高度产生14．63 kPa的眼内压力,缺血时间60 min,分别再灌注0、2、6、12、24、48、72 h。实验过程中保持动物体温36．5℃～37℃。并间断点抗生素眼药水,拔除穿刺针后,涂抗生素眼膏。对照组动物做前房穿刺后留置针头1 h后拔除。
1．4 SOD、MDA及NO的测定 过量麻醉法处死大鼠,迅速摘除眼球,置于冰环境中。环行切开角巩膜缘,弃去眼前节及玻璃体。外翻眼球壁,在解剖显微镜下剥离视网膜,电子天平称湿重。进行匀浆，将匀浆液倒入离心管,3000 r/min,离心15 min。取上清液进行比色测定, 按试剂盒说明书操作。
1．5 组织学观察 按照文献报告的方法测定视网膜tingting6965096
厚度 [3]。未进行任何操作的4眼(取对照组中未做任何处理的另一眼)作为视网膜测量的正常对照组。用目镜上的刻度测量距视盘边缘1．5 mm处视网膜内层厚度(指视网膜内界膜到外核层和外网状层交界处之间的距离)。
1．6 统计学方法 采用SPSS10．0统计软件分析,组间不同时间点作单因素方差分析并进行两两比较,数据均用均数±标准差(x±s)表示。
2 结果
2．1 牛磺酸对大鼠缺血再灌注损伤后视网膜SOD、MDA和NO水平的影响 大鼠视网膜缺血再灌注后，缺血组视网膜内MDA含量逐渐上升，72 h达顶峰，保护组在各时间点维持在正常水平；缺血组再灌注后视网膜内SOD水平逐渐下降，72 h时达到最低点，各时间段模型组视网膜SOD含量均明显低于正常组（P<0．01），而保护组0、2、6、12、24 h各时间段SOD水平与对照组差异无统计学意义（P＞0．05）,48、72 h均低于对照组（P<0．01），保护组与缺血组比较0、2、6、12、24 h各时间段SOD水平明显增高，48、72 h两组差异无统计学意义（P＞0．05）；缺血组再灌注后2 h，视网膜内NO含量逐渐上升，72 h达到高峰，2 h后各时段视网膜NO含量均明显高于对照组（P<0．01）,保护组在各时间点维持在正常水平。
2．2 形态学观察 正常组：Wistar大白鼠视网膜组织结构与人视网膜组织结构相似，内膜清楚；神经纤维层较稀疏，水平排列较规整；神经节细胞层大多呈单层排列，胞核较大，呈圆形或椭圆形，染色较淡，排列整齐；内网层较厚，约为内核层两倍，呈较明显的网状结构，较疏松；内核层由3～6层细胞构成，胞核较大，染色稍深，排列整齐，厚度约为外核层的2/3；外网层明显薄于内网层，网状结构也不如内网层明显。外核层较厚，由8～10层细胞组成；胞核较小，染色深，排列较紧密。外界膜整齐、清楚；杆锥体层呈规则的毛刷状，色素上皮层可见排列整齐的单层视网膜色素上皮细胞。
缺血组：缺血1 h，再灌注0 h，视网膜轻度水肿，神经纤维层疏松；再灌注2 h，神经纤维层和内丛层水肿，节细胞层和内核层部分胞核周围绕以透明晕，染色质边集现象出现；再灌注6 h，内层视网膜高度水肿，可见到核固缩死亡的神经节细胞，内丛层明显增厚，结构疏松，内核层部分细胞变圆变小，染色加深，并出现空泡；12 h水肿减轻；24 h水肿基本消失，神经纤维层变得扁平，节细胞层及内丛层有较多深染的胞核；再灌注48 h，内丛层轻度变薄，部分节细胞萎缩;再灌注72 h，神经纤维层明显变薄，内丛层进一步变薄，内核层细胞减少，部分胞核结构不清。
保护组：灌注0、2 h，也可见视网膜水肿；再灌注6 h内层视网膜高度水肿，但内丛层较缺血组薄；再灌注12 h水肿减轻；再灌注24 h水肿消退，偶见深染胞核；再灌注48、72 h时内丛层轻度变薄，但明显较模型组轻。各组均未见外层视网膜异常。
2．3 形态学测量 视网膜缺血再灌注0 h时,缺血组（112．50±3．47）和保护组（115．38±4．26）大鼠视网膜内层厚度明显超过正常组（101．50±4．92）,表明缺血组和保护组大鼠视网膜组织水肿较正常组严重，神经纤维层和内网状层尤为明显。随再灌注时间的延长,24 h后缺血组大鼠视网膜内层逐渐萎缩、变薄,而保护组大鼠视网膜内层厚度在2 h（118．16±1．25）、6 h（128．92±5．62）小于缺血组 ［（150．30±4．92），(162．57±2．42）］,24 h（100．85±2．65）、48 h（82．35±3．52）大于缺血组［（100．85±2．65）, (82．35±3．52）］，二者比较差异有统计学意义（P<0．05）。
3 讨论
本文采用维持眼压在14．63 kPa，1 h，造成急性视网膜缺血，而后迅速减压实现再灌注，此为目前被国内外广泛采用的损伤模型之一。已有证实巴比妥类麻醉剂对视网膜细胞无损害[3],因此可以排除麻醉药对结果的影响。
视网膜缺血再灌注损伤是由多种因素介导的复杂病理生理过程,而自由基连锁反应是造成组织损伤的核心环节。MDA是各类自由基攻击细胞膜中不饱和脂肪酸后形成的脂质过氧化稳定产物, SOD是氧自由基的特效专一清除酶。视网膜缺血再灌注引起细胞内Ca2+超载并刺激Ca2+依赖的nNOS (神经型一氧化氮合成酶)和eNOS (内皮型一氧化氮合成酶),NOS催化L-精氨酸与分子氧反应生成NO[4]。NO通过介导谷氨酸等兴奋性氨基酸导致细胞毒性作用，此外还可与超氧自由基结合，分解出毒性更大的羟基自由基，NO还可通过被动转运很快离开细胞，而对邻近细胞产生毒性作用。缺血后视网膜各层变薄的程度表明视网膜细胞死亡的程度,缺血后视网膜的细胞死亡在内层视网膜最明显。
牛磺酸是体内一种非必需自由氨基酸,以较高的浓度存在于哺乳动物的视网膜、脑、心脏、肌肉等组织中，但视网膜、晶状体、神经组织对牛磺酸最为敏感[5]。视网膜内牛磺酸的生理浓度对维持视网膜细胞的正常功能至关重要。实验证明牛磺酸对谷氨酸诱导视网膜神经节细胞凋亡具有防护效应[6]，在狗的原发性青光眼模型中发现，视网膜的破坏与牛磺酸和谷氨酸从光感受器细胞丢失和谷氨酸在Muller细胞附近的堆积有关。且牛磺酸可抑制铁离子引发的家兔视网膜细胞脂质过氧化反应产物MDA生成。严灿荣等证实在失血性休克动物中牛磺酸能抑制视网膜组织中的NOS活性,减少NO生成。实验中发现牛磺酸治疗组各时间段NO、MDA含量均明显低于对照组;SOD活性先高于对照组,48 h后SOD活性又降低,不能确定牛磺酸对SOD作用。牛磺酸可能通过平衡钙离子稳态,减少nNOS的激活,使NO的生成减少,是否能保护SOD不能定论，它有可能直接分解MDA,或通过调节脂质过氧化反应的其他上游环节来减少MDA生成量，形态学上证实牛磺酸可明显减轻视网膜内层水肿及进一步的萎缩。
综上所述,牛磺酸可显著减轻大鼠视网膜缺血再灌注后的损伤,并首次观察到牛磺酸能对抗在体视网膜缺血再灌注后NO水平的升高,抑制脂质过氧化反应产物MDA,为牛磺酸作为一种视神经保护剂用于临床提供了有利的实验依据。
参考文献
［1］ Lieth E, Barber AJ,Xu B,et al.Glial reactivity and impaired glutamate metabolism in short-term experimental diabetic metinopaty. Diabetes, 1998,47:815-820.
［2］ Lan TT,Abler AS, Tso MO. Apoptosis and caspases after ischemia-reperfusion injury in rat retina . Invest Ophthalmol Vis Sci,1999,40(5):967.
［3］ Hughes WF. Quantitation of ischemic damage in the rat retina.Exp Eve Res,1999,53:573-582.
［4］ Goldstein IR, ostwald P, Roths.Nitric oxide :a review of its role in retinal function and disease.Vision Res,1996,36:2979-2994.
［5］ Franconi F, Loizzo A,Ghirlanda G,et al.Taurine supplementation and diabetes mellitus.Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 2006,9(1):32-36.
［6］ Madl JE, McIlnay TR, Powell CC，et al. Depletion of taurine and glutamate from damaged photoreceptors in the retinas of dogs with primary glaucoma. Vet Res,2005,66(5):791-799. |
