作者：邓宏伟，陈建苏，李辰，姚晓明，赵松滨，狄静芳
作者单位：中国广东省中医药管理局科研课题资助项目(No.100067);中国广东省卫生厅医学科学技术研究基金资助项目(No.A2001323) (518001)中国广东省深圳市,暨南大学附属深圳眼科医院; (510632)中国广东省广州市，暨南大学医学院眼科；组织移植免疫中心
【摘要】 目的:观察雷公藤多甙（ tripterygiitotorum,TII）及FK506滴眼液局部应用对大鼠角膜移植免疫排斥反应的影响。方法:建立大鼠角膜移植模型，随机按局部滴用药物分组成A,B,C组，用裂隙灯记录及比较各组移植排斥指数，并比较角膜排斥发生时间。分别于术后15d及30d行常规病理学检查。并通过免疫组化检查CD25,CD+54在角膜植片基质中的表达。结果: 0.3g/L TII及0. 5g/L FK506抑制角膜移植免疫排斥反应的效应均有效，两者相比效果无显著性差异。HE染色及免疫组化分析可见15d时各有效组角膜植片厚度基本正常，基质中仅有少量CD25, CD+54阳性细胞表达、淋巴细胞浸润，新生血管少见。结论: TII与FK 506疗效近似。具有抑制高危角膜移植免疫排斥反应发生的临床应用价值。
【关键词】 雷公藤多甙（TII）;角膜移植；移植物排斥
Comparison between the effect of Tripterygiitotorum(TII) and FK506 ophthalmic solutions on the corneal allograft rejection
HongWei Deng, JianSu Chen, Chen Li, XiaoMing Yao, SongBin Zhao, JingFang Di
Foundation items:Guangdong Administration of Traditional Chinese Medicine Research Projects(No.100067);Guangdong Provincial Health Office of Medical Science and Technology Research Fund Projects(No.A2001323)
Shenzhen Eye Hospital Affiliated to Jinan University, Shenzhen 518001, Guangdong Province, China;Department of Ophthalmology, Medical College of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province,China;Tissue Transplantation Immune Center, Medical College of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China
Abstract
AIM:To observe and compare the effect of the TII, FK506 ophthalmic solutions on the corneal allograft rejection.
METHODS: The corneal transplantation model on the closed colony rats were set up and then were randomly divided into A, B and C groups by the using of different eyedrops. Graft fate was assessed clinically by slitlamp biomicroscope examination, included the corneal clarity, edema and vascularization, and the rejection time. Respectively, after 15 days and 30 days of routine histopathological examination. And inspect expression by immunohistochemistry CD25, CD+54 in the corneal graft stroma.
RESULTS:There were no statistical different between group 0.3g/L TII and 0.5g/L FK506 in prolonging the corneal survival. While comparing the histopathological and immunohistochemistry findings between the groups, the results confirmed that the topical application of TII and FK506 eyedrops could significantly reduce the inflammatory cells infiltrating the graft stroma and the neovascularization, whilst reduce the production of ICAM1 and IL2.
CONCLUSION: The corneal allograft rejection could be significantly suppressed by the local use of TII ophthalmic solution. 0.3g/L TII has the same effect as the 0.5g/L FK506 in prolonging the corneal survival.
KEYWORDS: tripterygiitotorum(TII); keratoplasty; graft rejection
0引言
角膜移植免疫排斥反应是角膜移植失败的主要原因。寻找高效低毒的免疫抑制剂一直是临床面临的主要问题。目前预防和治疗角膜移植排斥反应的药物有皮质类固醇、环孢酶素A[1]以及FK506。FK506(Tarolimus)是一种与环孢酶素A作用机制类似的药物，是通过抑制混合淋巴细胞反应和细胞毒性T细胞来发挥免疫抑制作用，据报道其免疫抑制强度是环孢酶素A的10～100倍[2]。虽然目前已经研制出FK506局部应用的制剂，但由于其价格昂贵，尚未能在临床上普遍应用。雷公藤(tripterygium wilfordii Hook f., TWHf)有免疫抑制、抗炎、抗生育、抗肿瘤和抗菌作用。雷公藤多甙（tripterygiitotorum, TII）是其中多种成分（二萜内酯、生物碱、三萜等）的组合，即保留了雷公藤生药的免疫抑制作用，又去除了许多毒性成分[3]。全身应用雷公藤多甙片已证明可用于治疗实验性葡萄膜炎[4]，抑制实验性角膜移植排斥反应[5]，并在临床上已用于治疗眼部的多种免疫性疾病以及炎症性疾病，如：巩膜炎[6]、蚕食性角膜溃疡等免疫性角膜病、白内障术后的炎症反应[7]、春季卡他性结膜炎、青睫综合征等其他免疫性眼病[8]。上述治疗虽疗效显著，但仍出现胃肠不适和可逆性抑制精子活性等副作用。为避免雷公藤制剂全身应用所带来的毒副作用，本研究研制出TII滴眼液，并将其应用于大鼠角膜移植排斥模型。观察并比较雷公藤滴眼液与0.5g/L FK506对角膜移植免疫排斥反应的抑制作用。
1材料和方法
1.1材料 雌性SD（SpragueDawley）大鼠30只，体质量：180±10g，Wistar大鼠9只，雌性，体质量：200±10g，由中山医科大学动物中心提供，普通级。TII滴眼液研制：取相应计量TII粉（由三九制药厂提供）配制成300mg/L质量浓度的TII滴眼液以及空白对照（仅含滴眼液基质成分，即含有20g/L DMSO和900mL/L人工泪液）滴眼液，将所有滴眼液调PH值于6～7，采用加热灭菌方式制药，全过程在暨南大学一附院中药制剂室完成。0.5g/L FK506滴眼液购于中山眼科。兔抗大鼠mAb：抗CD25,抗CD+54均由DACON提供，二抗：羊抗兔血清，过氧化酶标记的免疫组化二步法试剂盒[DACON EnVision TM试剂盒（兔/鼠双标）]。AB（Dianinobenzidine tetrahydrochloride）染色液：溶解4～6mg DAB于0.05mol/L pH 7.6的Tris缓冲液10mL中，充分溶解后过滤。避光保存，用前加入300mg/L H2O2 3μL。DAB: 3,3’二氨基联苯胺（呈棕色），为过氧化酶的供体氢。
1.2方法 氯氨酮（50mg/kg）＋氯丙嗪（25mg/kg）注射液的混合剂ip全身麻醉。所有动物均选择右眼为术眼，于术前15min起点复方托品酰胺滴眼液及10g/L的卡因滴眼液各3次，间隔5min。常规消毒铺巾，在手术显微镜下取3.25mm角膜中央全层植片立即植入同等大小角膜中央穿透性植床，用（10 0）进口尼龙线间断缝合8针，术毕前房内注入少量平衡盐溶液，形成前房。建立大鼠角膜移植模型。术后5d局部常规应用3g/L妥布霉素滴眼液，4次/d。角膜移植术后第5d排除术后发生虹膜嵌顿、前房积血及晶状体混浊眼，将手术成功例随机分组，每组10只。 3组均为WistarSD大鼠组间同种异体角膜移植组，即Wistar为供体，SD为受体。于术后5d开始应用相应滴眼液，5次/d，直至角膜移植排斥反应发生。A组：滴用空白对照滴眼液， B组：滴用0. 3g/L TII滴眼液，C组：滴用0. 5g/L FK506滴眼液。术后4d起每2d用裂隙灯显微镜观察1次，以角膜透明度、水肿度、新生血管度为指标，参考Holland等制定的标准[9]，记录移植排斥指数（rejection index，RI）（0～12分）。以角膜混浊、水肿和新生血管3项评分之和为RI，当RI≥6时，为角膜排斥反应发生。记录各组角膜排斥发生的时间。术后15d及30d，每组分别处死2只大鼠，取其完整眼球，于40g/L甲醛液固定，常规石蜡包埋，HE染色，显微镜下观察，摄像。用常规石蜡包埋后的眼球组织，切片固定于有明胶的载玻片上，行EnVision工作程序染色（即改良的ABC染色法），一抗（兔抗大鼠mAb）：抗CD25,抗CD+54，二抗：羊抗兔血清，阴性对照用PBS代替一抗，DAB显色，苏木素复染，镜检摄像。
图1各组角膜移植植片的KaplanMeier生存率曲线（略）
统计学分析:用SPSS 10.0医学统计软件，取双因素方差分析各组间的差异、RI的差异以及排斥发生天数的差异，P＜0.05为显著性差异。
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