人参皂甙Rg1、Rb1和维生素E对氧化损伤的牛RPE细胞凋亡的影响△

　　眼科新进展 1999年第3期第19卷 研究原著

　　作者：鹿庆　孙葆忱　王津津

　　单位：100730　北京市眼科研究所WHO防盲合作中心(鹿庆、孙葆忱)；北京同仁医院中心实验室(王津津)

　　关键词：视网膜色素上皮细胞；自由基；人参皂甙类；维生素；细胞凋亡

　　摘要　目的　检验氧化损伤的牛RPE细胞是否存在着凋亡以及人参皂甙Rg1、Rb1和维生素E对其的影响，以期进一步研究RPE细胞氧化损害的机理，并试图为预防和治疗与RPE细胞相关的视网膜疾病提供有效的手段。方法　建立牛RPE细胞氧化损伤模型，利用原位末端标记技术测定RPE细胞凋亡。结果　发生凋亡的RPE细胞细胞核染成紫蓝色，形态不一，往往成颗粒状着色，与次黄嘌呤(HX)/黄嘌呤氧化酶(XO)(HX=0.1mmol·L-1，XO=5U·L-1)组阳性细胞数相比较，正常对照组Rg1(0.1mg·L-1)组及维生素E(10mg·L-1)组存在显著性差异(P＜0.05)，而与Rb1(10mg·L-1)组无显著性差异。结论　氧化损伤可使培养的牛RPE细胞发生凋亡。人参皂甙Rg1和维生素E对抗氧自由基对RPE细胞损伤的机制可能是通过清除氧自由基、减少RPE细胞脂类过氧化的发生，从而有效地抑制RPE细胞凋亡，利于RPE细胞的生存。

　　［眼科新进展 1999；19(3)∶152-154］

　　Influence of ginsenoside Rg1,Rb1 and vitamin E on apoptosis of oxidized bovine RPE cells in vitro

　　LU Qing,SUN Bao-Chen,WANG Jin-Jin

　　Abstract　Objective　To investigate whether apoptosis is exited in bovine RPE cells damaged by oxygen free radicals,and whether ginsenoside Rg1、Rb1 and vitamin E have an influence on apoptosis of oxidized RPE cells.Methods　The experimental model of oxidized bovine RPE cells was made.In these cells,apoptosis was evaluated by in situ TdT-mediated biotin-dUTP nick-end labeling(TUNEL).Results　Apoptosis was visualized by the in situ end-labeling in RPE cells,the apoptosis cells' nucleus were stained purplish blue.Compared to the control,the number of apoptosis cells with hypoxanthine(HX)/xanthine oxidase(XO) (HX=0.1mmol·L-1, XO=5U·L-1) treatment significantly increased (P＜0.05).Rg1(0.1mg·L-1)),and vitamin E (10mg·L-1)significantly decreased the number of apoptosis RPE cells in oxidized RPE cells in comparision with HX/XO treatment(P＜0.05),Rb1(10mg·L-1)had no significant effect(P＞0.05).Conclusions　Oxygen free radicals can result in apoptosis.Ginsenoside Rg1 and vitamin E can inhibit the apoptosis,Rb1 had no effect on it.These results indicate that Rg1 and vitamin E probably inhibited apoptosis by clearing free radicals and decreasing lipid peroxidation of bovine RPE cells.

　　Key words　RPE cell;free radicals;gingseng saponins;vitamin;apoptosis

　　［Rec Adv Ophthalmol 1999;19(3)∶152-154］

　　细胞凋亡是细胞对不引起细胞立即死亡剂量的非毒性刺激作出的反应［1］，这些刺激包括辐射、高热、化学毒性、撤除糖皮质激素以及各种细胞因子等。在某些条件下，超氧化物离子和过氧化氢亦可成为细胞凋亡的有力诱导剂，可引起DNA链断裂和膜发泡。已证明［2］，诱导凋亡的因子很多是氧化剂或细胞氧化代谢的刺激剂，相反，许多凋亡的抑制剂有抗氧化作用或能增强细胞的抗氧化能力。根据以上的研究结果，我们研究了氧化损伤的RPE细胞是否存在着凋亡和人参皂甙Rg1、Rb1和维生素E对其的影响，以期进一步研究RPE细胞氧化损害的机理，并试图利用上述药物人为地干预RPE细胞凋亡，从而提供预防和治疗与RPE细胞相关的视网膜疾病的有效手段。

　　1　材料和方法

　　1.1　试剂　牛眼球购买于北京市清真食品厂，细胞培养基DMEM(GBRL)，NBT和BICP(GBRL)，SP-AP(GBRL)，Bio-11-dUTP(北京医科大学药学院合成)。Rb1、Rg1为纯品购于中国药检所，维生素E(Sigma)。上述药品均用DMEM培养液配制成1g·L-1的工作浓度，并进行过滤消毒。

　　1.2　方法

　　1.2.1　牛RPE细胞培养的方法与鉴定参见Kelley的方法［3］。

　　1.2.2　RPE细胞氧化损伤模型制作　本研究利用次黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶反应产生氧自由基。分别将次黄嘌呤(hypoxanthine,HX)溶于Hank液中过滤消毒，黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)直接溶于消毒后的液中。取生长良好的传代牛眼RPE细胞(1～4代)消化后悬浮于含100mL·L-1的胎牛血清的DMEM培养液中，以10×106个·L-1浓度接种于24孔孔板中，培养24～72h后，将原培养基吸出，换入含50mL·L-1的胎牛血清的DMEM培养液，同时加入HX/XO(HX浓度为0.1mmol·L-1，XO浓度为5U·L-1)，继续培养24h，消化后涂片做试验。

　　1.2.3　选择生长良好的RPE细胞用于本实验。实验分为5组，Ⅰ组为正常对照组(1mL DMEM培养液)；Ⅱ组为HX/XO损伤组(HX浓度为0.1mmol·L-1，XO浓度为5U·L-1)；Ⅲ组为Rb1组(10mg·L-1)；Ⅳ组为Rg1组(0.1mg·L-1)；Ⅴ组为维生素E组(10mg·L-1)。

　　1.2.4　原位末端标记技术测定细胞凋亡　(1)RPE细胞固定：将传代细胞用胰酶消化后，用PBS洗2遍、离心后滴在载玻片上，用甲醇∶冰醋酸3∶1，固定细胞15min；(2)DNA末端转移反应：加入TdT反应液50μL，37℃温育1h，然后用反应终止液、PBS洗2遍；(3)加入SA-AP反应液100μL到每个载物片的细胞上，37℃温育15～30min，用碱性磷酸酶反应底物液洗3遍，每次15min；(4)显色反应：4.4μL NBT加入到1mL碱性磷酸酶反应底物液中，混匀后加入3.3μL BCIP。37℃温育0.5～1h。待阳性结果出现后用20mmol·L-1Tris.Cl(pH 7.5)、8mmol·L-1EDTA终止反应，显微镜下观察结果并照相；(5)判断：RPE细胞凋亡阳性表现为细胞核呈紫蓝色着色。

　　1.2.5　统计处理　统计学处理采用χ2检验

　　2　结果

　　在原位末端标记的牛RPE细胞涂片上，可见染成紫蓝色的细胞核，形态不一，往往成颗粒状着色(见图1)。在HX/XO组和Rb1组中，核染色的细胞较多，而在对照组，Rg1组和维生素E组中，核染色的细胞明显减少。为能定量观察RPE细胞凋亡的情况，在显微镜下记数6个中倍镜视野中的阳性细胞总数，进行统计分析。

　　Figure 1　Apoptosis of bovine RPE cells were showed by

　　TUNEL technique,the apoptosis cells' nucleus were stained purplish blue，250×

　　原位末端标记法显示凋亡的牛RPE细胞，其细胞核上可见紫蓝色颗粒

　　状着色，有的呈半月状，有的呈环状，250×

　　表1显示，与HX/XO组阳性细胞数的百分率相比较，正常对照组，Rg1(0.1mg·L-1)组及维生素E(10mg·L-1)组存在显著性差异(P＜0.05)，而与Rb1(1mg·L-1)组无显著性差异。上述结果提示，氧化损伤可导致牛RPE细胞发生凋亡，Rg1和维生素E有抑制氧化损伤造成的牛RPE细胞凋亡发生的作用，而Rb1效果不明显。

　　表1　Rg1、Rb1及维生素E对RPE细胞凋亡的影响

　　3　讨论

　　凋亡细胞通常显示核固缩、质膜发泡、细胞器的紧缩、凋亡小体的形成等一系列形态上的变化［4］。许多化学和物理方法诱导凋亡能产生氧压力，如离子化或紫外线照射能诱导凋亡，并产生氧中间体(ROI)如H2O2、OH·[5]。氧压力也可由于细胞清除ROI的能力降低而产生，从而使细胞更易受氧诱导而发生凋亡。ROI的增加或细胞内抗氧化剂的清除均可导致凋亡，而通过加入抗氧化剂可阻止凋亡的发生［6，7］。

　　人参皂甙Rb1和Rg1是人参的主要有效成分，均具有抗自由基作用［8，9］，维生素E可能是目前唯一得到很好认识的脂溶性破链抗氧化剂。本研究利用原位末端标记技术发现HX/XO系统损伤后的牛RPE细胞存在DNA链的断裂，从而证实氧化损伤可造成牛RPE细胞的凋亡。而人参皂甙Rg1和维生素E作为一种抗氧化剂，保护RPE细胞对抗氧化损伤的机制可能与有效地清除了氧自由基，抑制RPE细胞脂质过氧化的发生，增强RPE细胞抗凋亡的能力有关。但由于Rb1无法有效地抑制RPE细胞的凋亡，故推测，Rg1、维生素E抑制氧自由基诱导的RPE细胞凋亡的作用，可能不单单与减少RPE细胞脂质过氧化的生成有关，还可能与Rg1、VitE通过其它途径抑制了自由基的氧化损伤作用有关，而这种作用可能是Rb1所不具备的，其机制有待于进一步研究。以上的研究提示人参皂甙Rg1和VitE作为一种有效的抗氧化剂可能在治疗与RPE氧化损伤相关的疾病中有着重要的临床价值。

　　△　北京市自然科学基金资助项目(基金编号7962007)

　　Accepted for publication Sep 25,1998

　　From the Beijing Institute of Ophthalmology,WHO Collaborating Center for Prevention of Blindness(LU Qing,SUN Bao-Chen),Beijing 100730,P.R.China;The Central Laboratory,Beijing Tongren Hospital(Wang Jin-Jin),Beijing 100730,P.R.China

　　作者简介：鹿庆，男，1969年4月出生，山东菏泽人，汉族，1998年7月毕业于首都医科大学，获医学博士学位。现为北京市眼科研究所助理研究员，已发表近10篇论文，获山东省医学科技进步二等奖1次，现为北京市自然科学基金资助课题的主要承担者之一。业余爱好读书、旅游。联系电话：010-65244523，E-mail:[email protected]

　　参考文献

　　1　Sarraf CE,Ansari TW,Conway P,et al. Bromodeoxyurine-labblled apoptosis after treatment with antimetabolites in two murine tumors and in small intestinal crypts.Br J Cancer 1993;68∶678-680.

　　2　Thomas MB,Paul AS.Oxidative stress as a mediator of apoptosis.Immunol Today 1994;15(1)∶7-10.

　　3　鹿庆，孙葆忱(综述).视网膜色素上皮的体外培养.眼科 1996；5(4)∶241-243.

　　4　Kerr JFR，Searle J. Apoptosis.Rec Adv Histopathol 1972；12∶1-15.

　　5　童新，孙志贤.辐射所致程序性细胞死亡的机制.国外医学分子生物学分册 1995；17(3)∶131-135.

　　6　Hedley DW,McCulloch EA.Generation of reactive oxygen intermediates after treatment of blasts of acute myeloblastic leukemia with cytosine arabinoside:role of bcl-2.Leukemia 1996;10(7)∶1143-1149.

　　7　Ramarkrishnan N，Catravas GN.N-(2-mercaptoethyl)-1,3-propanediamine(WR-1065)protects thymocytes from programed cell death.J Immunol 1992；148∶1817-1821.

　　8　Zhong GG,Sun CW,Li YY,et al. Calcium channel blockade and anti-free radical actions of panaxadiol saponins Rb1,Rb2,Rb3,Rc,and Rd.Acta Pharmacol Sin 1995;16(3)∶255-260.

　　9　Jiang Y,Liu W,Wang XM,et al. Calcium channel blockade and anti-free radical actions of panaxadiol saponins in cultured myocardiocytes.Acta Pharmacol Sin 1996;17(2)∶138-141.

　　收稿　1998-09-25　修回　1998-11-11