【摘要】目的：克隆NYDSP15基因，构建融合表达载体，在大肠杆菌中表达，并制备抗体。
方法：PCR技术扩增NYDSP15全长开放阅读框，克隆入原核表达载体PET28a，转化大肠杆菌感受态细胞，异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）诱导后收集菌体蛋白，行SDSPAGE电泳。将此融合蛋白Ni柱纯化后免疫BALB/C小鼠，Western blotting鉴定。
结果：成功地构建了PET28aNYDSP15原核表达质粒，并获得了高效表达NYDSP15的BL21菌株，表达的His标签融合蛋白，分子量为58kDa左右，经免疫小鼠获得了抗NYDSP15抗体。经Western blotting法分析，抗体为NYDSP15特异性抗体。
结论：构建的 NYDSP15 基因的原核表达载体，体外高效表达蛋白，免疫小鼠获得抗NYDSP15抗体，将为眼部增殖性视网膜病变（PVR）的研究及治疗奠定坚实的基础。
【关键词】 原核表达；NYDSP15；多克隆抗体
Prokaryotic expression plasmid of NYDSP15 and preparation of polyclonal antibody
Zhen Wang, QingHuai Liu, Jie Chen, Yun Wang, JianMin Li
Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 30000088 )
1 Department of Cell Biology and Medical Genetics, School of Basic Medical Sciences, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China;
2 Department of Ophthalmology, Peoples Hospital, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
Correspondence to: QingHuai Liu. Department of Ophthalmology, Peoples Hospital, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China. [email protected]; JianMin Li. Department of Cell Biology and Medical Genetics, School of Basic Medical Sciences, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China. [email protected]
Abstract AIM: To construct the prokaryotic expression plasmid of NYDSP15 which is related to proliferative lesion, induce protein expression in vitro and immunize mouse for antibody.METHODS: Openreading frame of NYDSP15 gene was amplified by PCR technique, then we inserted it into PET28a prokaryotic expression vector and transformed into expressing strain. Its protein expression was inducedby isoproprlthiogalactoside (IPTG), then purified by Ni stele. Eightweekold BALB/C mice were immunized by the purified protein to obtain antibody. The protein and its antibody were checked by Western blotting technique.RESULTS: We had successfully constructed NYDSP15 prokaryotic plasmid, and the BL21 strain that highly expressed NYDSP15 protein. The molecular weight of this His taggedfusion protein was about 58 kDa. Polyclonal antibody was gained from immune mouse and the specificity was determined by Western blotting.CONCLUSION: NYDSP15 prokaryotic expression vector, the highly expression protein in vitro and its polyclonal antibody may establish a substantial foundation for the research and treatment of the proliferative retinopathy.
KEYWORDS: prokaryotic expression; NYDSP15; polyclonal antibody
0引言
增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy, PVR）是在孔源性视网膜脱离、视网膜复位手术后[13]、以及眼外伤后，由于玻璃体内及视网膜表面的细胞增生和收缩，导致孔源性或牵引性视网膜脱离的病变，是视网膜脱离复发乃至失明的重要原因[4,5]。研究证实，主要是视网膜色素上皮细胞，其次巨噬细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞等参与了病变形成的过程[6]。然而，对于PVR发生的分子生物学机制仍不是十分清楚，特别是PVR的发生牵涉到哪些基因的表达与调控，是目前PVR研究的热点。NYDSP15基因是我们克隆的人类新基因，在前期的研究中发现它的表达与细胞增殖相关[7]，并在PVR增生组织中高表达。为了解该基因功能及它在眼部增生性病变中的作用，特别是在PVR增生中的作用，我们构建了该基因的原核表达载体，表达并纯化了NYDSP15蛋白，经免疫小鼠获得了抗体，为进一步研究NYDSP15基因功能奠定了基础。
1材料和方法
1.1材料
Taq DNA聚合酶、dNTP，WizardPCR Preps DNA Purification System均购自美国promega公司，UltraSepTM Extraction Kit购自OMIGO公司。高纯小量质粒提取试剂盒购自南京天为时代生物技术公司。NiNTA His BindResins,rLysozymeTM Solution购自于Novagen公司。DNA Marker DL 2000、限制性内切酶Sfi I、DNA凝胶回收试剂盒购自大连TaKaRa公司。8wk龄 BALB/C小鼠购于上海斯莱克动物研究中心。
1.2方法
1.2.1重组质粒的构建
以含NYDSP15全长ORF质粒为模板，行PCR扩增。扩增条件如下：94℃，5min。随后30轮循环包括：94℃，30s；55℃，30s；72℃，3min，延伸时间10min。上下游引物分别为5CATGGCCAATCCGGCCATGAAAGAAGCTGGGCAGATG3,5CAGGGCCTCTAAGGCCGTGGATTCCGAGGCGCAGCTTC3，PCR扩增产物纯化、
Sfi I酶切，回收，纯化。表达载体PET28a也用Sfi I酶切，并回收纯化，连接，转化到E. coli DH5α感受态细胞，PCR鉴定,并送英骏(invitrogen)公司测序。高纯小量质粒提取试剂盒提取重组PET28a6HisNYDSP15质粒。
1.2.2目的蛋白的诱导、纯化
重组质粒转入BL21表达菌株，挑BL21表达菌株单克隆，转入LB/卡那霉素培养基中，37℃振荡过夜，次日，将培养物按1∶100的比例接种到LB/卡那霉素培养基中，37℃、250r/min，培养至对数生长中期（OD600：0.4～0.6）后，加1mol/L IPTG至终浓度为1mmol/L诱导，不加入IPTG者为阴性对照。离心收集菌体，12% SDSPAGE电泳鉴定。按照NiNTA His. BindResins说明,采用金属亲和层析色谱法，非变性纯化目的蛋白，用Bradford法建立标准曲线，测定蛋白浓度。12% SDSPAGE电泳分析结果。
1.2.3免疫小鼠制备抗体
首次免疫，取纯化后的抗原蛋白80μg和等量的福氏（Frunds）完全佐剂混合乳化后，皮下多点注射小鼠颈背部及腹股沟。加强免疫共3次，蛋白量同前，混入等量的Frunds不完全佐剂。每次免疫间隔约2wk，第4次免疫后，第5d，采取夹眼球取血，离心取血清。
1.2.4 Western blotting检测
融合蛋白NYDSP15经SDSPAGE后电转移（100V，2h, 4℃）至硝酸纤维素膜上，PBST（80mmol/L Na2HPO4, 20mmol/L NaH2PO4, 100mmol/L
KCl, 1g/L Tween 20）数次洗膜后，5g/L脱脂奶粉封闭2h，依次滴加鼠抗NYD－SP15抗血清（室温反应2h,PBST洗涤4次）及辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（室温反应2h）。辣根过氧化物酶（DAB）显色，拍照。
2结果
2.1 PET28a6HisNYDSP15原核表达质粒构建
PET28a载体酶切纯化后，电泳可见两个大小不同的片段，小片段为原载体上的连接物，而大片段为质粒载体（图1）。 NYDSP15基因全长ORF，经30轮循环的PCR扩增后，产物经纯化、 Sfi I酶切后，再切胶纯化后，结果片段大小为1545bp（图2）。把目的片段和酶切纯化后的PET28a载体连接,转化DH5α、PCR鉴定，电泳结果 (图3)显示与靶基因片段大小相同为1 545bp，为避免错误连接,抽提PET28a6HisNYDSP15质粒，并用Sfi I酶切鉴定 (图4)，电泳显示插入片段大小也与靶基因一致为1 545bp,双重验证的阳性克隆送上海英骏生物公司测序，测序结果用Gene Runner软件分析，表明实验结果正确与原有的NYDSP15基因序列100%相符,并有正确的开放阅读框。这些结果证实我们成功构建了PET28a6HisNYDSP15的原核表达质粒。
通过时间梯度蛋白诱导表达分析中，3～4h即可诱导出NYDSP15蛋白的高表达，诱导出的蛋白条带，大小为50～66kDa之间，符合预期的NYDSP15蛋白大小58kDa（图5）。大规模诱导后,取诱导后细胞沉淀裂解物,按公司操作方法,过Ni柱纯化，用1×NiNTA Elute Buffer缓冲液析出NYDSP15蛋白，经脱盐柱脱盐,用Bradford法测定蛋白浓度后,将蛋白浓度调整至4g/L, 20μg蛋白经12%的SDSPAGE凝胶电泳分析（图6），显示得到了高纯度的NYDSP15蛋白。
2.2抗NYDSP15蛋白多克隆鼠抗体的制备及鉴定
取纯化后的抗原蛋白80μg和等量的Frunds完全佐剂混合乳化后，皮下多点注射小鼠颈背部及腹股沟。加强免疫（蛋白量同前，混入等量的Frunds不完全佐剂）3次。每次免疫间隔约2wk，第4次免疫后，第5d，采取夹眼球取血，离心取血清，即为多克隆鼠抗体。融合蛋白NYDSP15经SDSPAGE后电转移（100V，2h, 4℃）至硝酸纤维素膜上，运用Western blotting法分析、检测抗体，抗原为纯化的蛋白，一抗为免疫小鼠获得的抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG。重组表达蛋白在58kDa见单一清晰条带（图7）。
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