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3讨论
本研究所采用的PET28a 原核表达载体为6His融合蛋白表达载体,所表达的蛋白产物在N末端带有6 个连续的组氨酸,蛋白产物可通过亲和层析快速、简便地纯化。所构建的PET28a6HisNYDSP15原核表达载体通过酶切、基因测序等方法的鉴定表明，它与NYDSP15基因所标识的序列比较完全相符。
重组质粒转入大肠杆菌，获得了高效表达NYDSP15的BL21菌株，并利用该基因的蛋白，免疫小鼠获得抗NYDSP15抗体，体外Western blotting法检测显示条带清晰，反应强烈，证明蛋白的抗原性及抗体的专一性、特异性较强。RPE细胞及视网膜增殖膜免疫组化显示该蛋白主要在增生的组织中表达,并且低表达于胞质，高表达于胞核（相关文章待后发）。NYDSP15基因是近来发现的与增殖性病变相关的全新基因，其对眼部病变，特别是对PVR发生机制的研究尚未有报道。该基因的Genebank号为AY027525，定位于人类染色体13q14.2，Gene BLAST分析表明其全长为3364bp,含有1545bp开放阅读框，编码514个氨基酸，等电点为8.04,假设的蛋白分子量约58kDa，我们诱导的蛋白大小也与此相符合。经SMART和BLAST查询，发现其所编码的蛋白质具有一个锌离子功能域两个dCMPcytdeam结构域，即胞苷脱氨酶（cytidine deaminase）和脱氧胞苷酸脱氨酶(dCMP deaminase)结构域[7]。胞苷脱氨酶（cytidine deaminase）和脱氧胞苷酸脱氨酶(dCMP deaminase)是与细胞增殖密切相关的两种酶。它们都属于将单核苷底物脱氨基化的酶家族，参与了细胞内嘧啶核苷的代谢与维持[8]。胞苷脱氨酶水解胞嘧啶为尿嘧啶，而脱氧胞苷酸脱氨酶则水解脱氧胞苷酸（dCMP）为脱氧尿苷酸(dUMP)，锌离子功能域起到协助酶的催化活性作用[9,10]。胞苷脱氨酶广泛分布于真核生物的组织。脱氧胞苷酸脱氨酶在DNA复制过程中起着重要作用，尤其在有丝分裂S期其活性增高，和细胞内TMP（甲氧苄氨嘧啶）从头合成途径有关[11]，并且在细胞DNA的合成中起到平衡dCTP(脱氧嘧啶核苷三磷酸)和TTP（胸腺嘧啶核苷三磷酸）的作用[10]，它是一种变构酶，能被dCTP激活,而被TTP抑制[12]。
目前，新发现一个家族能够在RNA或DNA水平将胞苷脱氨基化。这个家族的第一个成员是APOBEC1（apolipoprotein B mRNA editing catalytic polypeptide 1,编辑载脂蛋白B mRNA的催化性多肽1），它能够将载脂蛋白B信使RNA脱氨基化而产生一个未成熟终止子。在大肠杆菌的胞苷脱氨酶中发现APOBEC1有保守的活性位点功能域。此外，APOBEC1有一个独特的功能域含有两个苯丙氨酸残基和插入的4个氨基酸残基跨越活性位点功能域。该功能域在APOBEC家族包括激活诱导的胞苷脱氨酶（activationinduced cytidine deaminase，AID），APOBEC2，APOBEC3A和APOBEC3G在内的成员中均存在。AID在启动抗体类型转换重组，体细胞高突变和基因转化中至关重要[13]。它通过将免疫球蛋白位点上的胞嘧啶脱氨基化来启动这些过程，具有潜在的基因突变活性[14]。AID/APOBEC蛋白家族的许多成员都能够将单链多核苷酸上的胞嘧啶脱氨基化为尿嘧啶，从而实现各种各样的生理功能[15]。该家族的酶的过度表达会导致癌症，提示编码APOBEC家族的蛋白的基因是原癌基因[16]，与细胞增殖密切相关。AID、CDA、dCMP和APOBEC都仅有单一CMP活性位点，而NYDSP15蛋白是一个新型的含有两个dCMPcytdeam结构功能域的蛋白。NYDSP15促进细胞增殖的作用机制可能与它所编码的蛋白质的两个dCMPcytdeam结构域密切相关。大量研究证实，RPE增生并形成膜是PVR形成的主要原因。有研究表明，RPE增殖与某些基因的表达具有相关性。在RPE细胞培养液中加入cfos反义寡核苷酸（cfosASON）抑制cfos基因的表达可以显著地抑制RPE细胞的增殖[17]。采用脂质体介导的反义寡核苷酸技术阻断RPE细胞增生细胞核抗原（PCNA）的表达可以抑制RPE增生[18]。然而目前对于调控PVR发生的特异性基因及其功能研究尚处于探索阶段。
目前，我们实验获得了高纯度的NYDSP15蛋白，并且免疫小鼠得到了相应的抗NYDSP15抗体，该抗体为一全新的与增生性病变相关的多克隆抗体，该抗体的免疫成功将为以后的眼部增殖性病变PVR的增殖机理的研究提供重要的实验材料，也必将为以后的临床治疗提供一个新的途径。
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