【摘要】
目的：探讨IL2在角膜移植免疫排斥反应过程中表达的动态变化规律,转化生长因子β1(TGFβ1)对IL2表达的影响及TGFβ1的免疫抑制作用。
方法：建立大鼠穿透性角膜移植模型，分为实验组（同种异体角膜移植，使用TGFβ1眼液），实验对照组（同种异体角膜移植，使用氯霉素眼液）及空白对照组（自体角膜移植，使用氯霉素眼液）3组，分不同时间点用RTPCR法检测角膜植片中IL2 mRNA的含量变化，并进行显微镜观察，根据角膜移植植片水肿，混浊，新生血管3项指标进行排斥指数评分(RI)。
结果：实验组大鼠植片存活时间较实验对照组明显延长(19.3±1.4d vs 13.7±2.6d，P<0.01)；实验组各个时间点IL2mRNA的含量较实验对照组均有明显降低（P<0.01）。
结论：TGFβ1对大鼠穿透性移植术后的免疫排斥反应有明显抑制作用，并能下调植片中IL2的表达。
【关键词】 角膜移植 穿透性 转化生长因子β1 IL2
0 引言
在移植免疫应答中，Th1类细胞因子参与介导排斥反应的发生，而IL2属于Th1类细胞因子，是已被证明的促进免疫排斥反应的主要细胞因子，具有广泛的免疫调控和免疫增强作用。我们通过建立大鼠穿透性角膜移植模型，运用RTPCR方法检测术后不同时间段各组角膜中IL2 mRNA的含量，分析IL2及TGFβ1在角膜免疫排斥反应中的作用。
1材料和方法
1.1材料 供体采用健康雌性Wistar大鼠20只，受体采用健康雌性SD大鼠60只，体质量200～250g，鼠龄2～3mo，由重庆医科大学实验动物中心提供，分3组：实验组和实验对照组各20只，行同种异体角膜移植，空白对照组20只，行自体移植。无菌条件下，将TGF(购自美国R&D公司) 1μg融于生理盐水20mL中，充分混合，配成50ng/L的眼液，4℃冰箱保存备用。RTPCR试剂盒购自武汉博士德公司。
1.2方法 参照Williams等［1］方法，供体提供双眼角膜，受体均选择右眼手术。供、受体均于术前以100mL/L水合氯醛3mL/kg, ip麻醉加眼局部4g/L倍乐喜表面麻醉。受体眼在麻醉后点10g/L阿托品眼液3次致瞳孔扩大约4～5mm。常规消毒，在手术显微镜下，严格无菌操作。首先于供体Wistar大鼠角膜钻取直径为3.5mm植片（弯维纳斯剪协助取材），置于培养皿中，用粘弹剂透明质酸钠（爱维）保护角膜植片备用，于受体SD大鼠右眼用直径3.25mm环钻钻取中央区角膜制作植床（弯维纳斯剪协助制作植床），将植片置于植床，以100无损伤缝合线作间断缝合8针，线头不埋。自体移植组用3.5mm环钻钻取植片后将其旋转大约270°后原位缝合，以100无损伤缝合线作间断缝合8针，线头不埋。术毕，于前房内注入空气泡，结膜下注射庆大霉素0.1mL，结膜囊内涂红霉素眼膏。50丝线缝合睑缘1针，并于术后1d拆除。保留100线不拆直至取材。术后实验组滴用TGFβ1眼液，对照及自体移植组均用氯霉素滴眼液滴入结膜囊1～2滴，3次/d，自术后1d开始起在显微镜下进行临床观察，隔日1次，于显微镜下检查角膜移植片透明度及新生血管生长情况，并进行分级。参照Larkin等［2］制定的评分标准，包括植片新生血管，水肿，混浊3项指标，计算排斥反应指数(RI)，当RI≥5时，即认为排斥反应发生。取材前，用1g/LDEPC液浸泡手术器械及1mL离心管，在1，2，3，4wk4个时间点，分别处死3组各5只大鼠，严格无菌操作下，沿角膜植床切口取下整块供体角膜植片，放入EP管内，迅速放入液氮罐中冷冻保存备用。RTPCR引物合成引自文献［3］，并使用引物设计软件Oligo 5.0辅助设计，由上海生工生物工程公司合成：βactin：产物为296bp, Sense5CTGGAGAAGAGCTATGAGCTG3;Antisense5 AATCTCCCC TTCTGCATCCTGTC3; IL2：产物为340bp，Sense5GCGC ACCCACTTCAAGCCCT3; Antisense5CCACCACAGTTGC TGGCTGA3。于无酶条件下称取标本组织100mg，置于玻璃匀浆器中，加入4℃预冷的Trizol裂解液lmL，冰上匀浆l～2min；将匀浆转入1.5mL无酶EP管中，冰上放置5min；加入氯仿200μL，剧烈振荡混匀30s；离心12000r/min×5min；将上清液小心转移到无酶1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，室温下放置5min；再次离心12000 r/min×5min；小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失，用700mL/L乙醇溶液洗涤2次，每次700μL，12000 r/min×2min；尽可能彻底地吸走上清液，防止RNA沉淀丢失，在室温下使乙醇完全挥发。用DEPCH2O30μL溶解沉淀。最后测定RNA浓度、纯度及RNA完整性(图1)。在200μL的反应体系中进行扩增，其中包括总RNA 1μL，dNTP 1μL，MgCl2 2μL，10×RT buffer 1μL，FreeRNase dH2O 3.75μL，AMV 0.5μL，Oligo dtprimer 0.5μL，Rnase 0.25μL，轻轻混合均匀后离心3～5s；反应体系30℃保温10min，55℃加热30min，然后99℃灭活AMV逆转录酶5min，再离心3～5s。在逆转录的200μL PCR薄壁管中，依次加入5×PCR buffer 10μL，灭菌蒸馏水28.75μL， Taq酶0.25μL，移入200μL PCR管中，分别加入βactin和caspase3上下游引物各0.5μL；按PCR扩增条件进行扩增： 94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃7min，4℃保存。PCR反应产物12μL加载样缓冲液3μL，以1×TBE为电泳缓冲液，在15g/L琼脂糖凝胶上电泳约1h(电压70V)，电泳完毕后，将琼脂糖凝胶用图像分析仪进行图像分析。
图1 总RNA电泳图像（略）
统计学处理: 数据以均数±标准差（±s）表示，采用成组设计两样本均数的t检验，所有数据均应用医学统计软件SPSS13.0处理。P<0.05为差异有显著性。
2结果
2.1大鼠角膜植片存活情况 所有大鼠中，有2只发生麻醉意外死亡，4只发生术后前房出血，2只发生严重的虹膜前粘连，1只发生感染，以上大鼠均被剔除实验，并及时补充实验动物。观察满2mo。1wk没有排斥反应，按7d统计，其他组处死的大鼠，未发生排斥反应的按处死时间统计。结果表明：实验组角膜植片存活时间比实验对照组明显延长，差异显著（19.3±1.4d vs 13.7±2.6d，P<0.01），而空白对照组为22.3±2.3d。由此可见，TGFβ1能明显抑制大鼠角膜移植免疫排斥反应，延长角膜植片存活时间。
2.2角膜植片中IL2 mRNA的表达 在各组角膜中均检测出IL2 mRNA的表达。实验组不同时间段的IL2 mRNA的表达较相同时期的实验对照组及空白对照组均有明显的下调（P<0.01,表1，图2）。实验对照组和空白对照组中IL2 mRNA在2wk时表达最高，随着时间的推移而逐渐下降。实验对照组中IL2 mRNA的表达较相同时间点的空白对照组的表达明显增高（P<0.05）。
图2 术后角膜植片IL2 mRNA的表达（略）
表1 大鼠角膜移植术后角膜植片IL2 mRNA的表达水平 （略）
bP<0.01 vs实验组
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