作者：毛晓春,李贵刚,张虹
作者单位：（441021 )中国湖北省襄樊市，华中科技大学同济医学院附属襄樊医院眼科；（430030）中国湖北省武汉市，华中科技大学同济医学院附属同济医院眼科
【摘要】目的：观察阳离子脂质体LipofectamineTM 2000是否能介导目的基因转移至兔角膜内皮细胞，并优化转染条件。
方法：体外培养兔眼角膜内皮细胞，以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因，通过体外细胞转染实验，用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件，荧光显微镜观察目的基因的表达。
结果：角膜内皮细胞内可见脂质体介导的绿色荧光蛋白表达，LipofectamineTM在细胞融合度为80%～90％ ，脂质体/DNA为3L/g，脂质体的量为1.8μL，转染时间为5h时，转染效率最高。
结论：阳离子脂质体可有效介导目的基因转移至角膜内皮细胞内，GFP可作为报告基因优化脂质体转染条件。
【关键词】 角膜；内皮细胞；脂质体；基因转染
Optimization of parameters of exogene transfection of rabbit corneal endothelial cell in vitro mediated by liposome
XiaoChun Mao, GuiGang Li, Hong Zhang
Foundation item: National Natural Science Foundation of Hubei Province, China (No. 2003ABA150)
Department of Ophthalmology, Xiangfan Hospital Affiliated to Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Xiangfan 441021, Hubei Province, China; Department of Ophthalmology, Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China
Abstract
AIM: To evaluate the efficiency of liposome mediated gene transfer to corneal endothelial.
METHODS: Rabbit endothelium cells were cultured for in vitro test. With green fluorescence protein(GFP) as report gene，the transfection condition was optimized in cell confluence，liposome quantity，liposome/DNA ratio and transfecting time.
RESULTS: The GFP expression in corneal endothelial cells was observed. The highest transfecting efficiency of LipofectAMINE2000 would be obtained when cell confluence was 80%90％, liposome concentration 1.8μL, ratio of liposome/DNA3L/g and transfecting time was 5 hours.
CONCLUSION: Liposome is able to deliver genes to corneal endothelial cells with efficacy, the experiment impled result show that GFP is a convenient reporter gene.
KEYWORDS: corneal; endothelial cell; liposomes; gene transfection
0引言
阳离子脂质体属于非病毒介导的基因转染方法，其优点是毒性低、安全、无免疫原性。对于不同细胞而言，阳离子脂质体介导的基因转染的条件不同。影响阳离子脂质体载体转染效率因素包括：细胞融合度；阳离子脂质体与DNA的浓度；脂质体/DNA复合物的比例；转染孵育时间等[1]。以体外培养的兔角膜内皮细胞为靶细胞，以绿色荧光蛋白为报告基因，采用脂质体lipofectamineTM2000为介导体，评价质粒DNA 的转染效率与表达水平，优化脂质体的转染条件。
1 材料和方法
1.1材料 清洁级新西兰大白兔，同济医学院实验动物中心提供。LipofectamineTM2000 (美国Invitrogen公司)；pEGFPN 1；pcDNA3(美国ClonTech公司)；DMEM/F12培养基及胎牛血清；无血清培养基OptiMEM (美国Gibco公司)；质粒快速提取试剂盒(中国博大泰克公司)。
1.2方法 揭膜法取材，撕下带有内皮细胞的后弹力层, 剪切成2mm×2mm大小组织块，内皮面向上置于培养皿中，加培养液，置于37℃，50g/L CO2 培养箱中培养。原代培养兔角膜内皮细胞，每2～3d换液1次，80%融合后采用2.5g/L胰蛋白酶消化传代。pEGFPN1 转化大肠杆菌DH5α，卡那霉素(50mg/L) 筛选阳性菌落，LB培养基扩大培养，用质粒提取试剂盒提取pEGFPN1基因。所得质粒A 260/ A 280 为1.812，含量为0.5～1.5g/L。LipofectamineTM2000介导pEGFPN1质粒转染兔角膜内皮细胞流程参照脂质体转染细胞的操作说明书进行，于转染前24h接种细胞，待细胞生长至适当的融合状态，用无血清培养基洗涤细胞2次，将适量DNA 及脂质体分别溶于一定量的无血清培养液中，将两者混匀，室温放置20min，混匀，倒入培养皿，37℃，50g/L CO2 培养箱培养2～8h 后，换成含100g/L血清的培养液，继续培养48h 后检测转染效率。于倒置荧光显微镜下观察、计数发绿色荧光细胞数，每孔取5个视野，取其平均值计算转染效率，(绿色荧光细胞数/细胞总数)×100%。1.25g/L胰蛋白酶消化成单细胞，DHanks 液漂洗,1500r/min 离心5min ,重悬于PBS 中, 流式细胞仪检测GFP 阳性细胞的百分率。
1.2.1细胞融合度对转染效率的影响 于转染前24h，将角膜内皮细胞以1.25g/L胰酶消化后用含100g/L胎牛血清的DMEM稀释至1×108/L后，在24孔板中分别种植300，350，400，500μL的细胞，加培养液至1mL继续培养，待细胞融合度为60%～70％，71%～80％，81%～90％，>90％时进行转染，方法如上。
1.2.2 转染孵育时间对转染效率的影响 在最佳细胞融合度进行转染。取1.8μL脂质体溶于50μL的OptiMEM中，0.6μg质粒溶于50μLOptiMEM中，按上述步骤转染，37℃分别培养2，5，8h，换含100g/L胎牛血清的DMEM培养基继续培养。
1.2.3脂质体浓度对转染效率的影响 转染前24h，将角膜内皮细胞以1.25g/L胰酶消化后用含100g/L血清的DMEM稀释至1×108/mL后接种于24孔板中，在最适合的融合度情况下进行角膜内皮细胞转染，在转染中分别取0.6，1.8，4.8μL脂质体溶于的OptiMEM中室温下静置5min，分别取0.2，0.6，1.6μg质粒溶于50μL的OptiMEM中室温下静置5min，将两液对应混匀，室温下静置20min，其后转染步骤同上。
1.2.4脂质体与质粒DNA比例对转染效率的影响 消化接种细胞于24孔板中，在最适合的融合度情况下进行角膜内皮细胞转染，取1.8μL脂质体溶于50μL的OptiMEM中室温下静置5min，另分别取0.3，0.6，0.9μg pEGFPN1质粒与无血清OptiMEM培养液50μL混匀，5min后合并两液，按上述步骤转染。
统计学处理：应用SPSS 11.0 统计软件, 以χ2检验对比分析不同组间转染效率。
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