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2 结果
2.1细胞融合度对转染效率的影响 于24孔板中角膜内皮细胞融合度分别为60%～70％，71%～80％，81%～90％及>90%时进行质粒的脂质体转染，48h后荧光显微镜下观察不同融合度情况下转染效率的差别，发现在细胞融合度为81%～90％时角膜内皮细胞的转染效率最高（图1）。
2.2转染孵育时间对转染效率的影响 在细胞融合度为81%～90％，每孔脂质体的量均为1.8μL时，按照脂质体与质粒DNA的比例为3∶1的比例进行角膜内皮细胞转染，分别于转染后2，5，8h弃去转染液，换含100g/L胎牛血清的DMEM培养基继续培养，48h后倒置荧光显微镜下观察转染效率的差别，在转染液孵育5h的转染效率最好（图2）。转染孵育时间超过8h，光学显微镜下可见细胞死亡。在24孔板中，细胞融合度为81%～90％，每孔脂质体的量为1.8μL，脂质体与质粒DNA的比例分别为3∶1，转染孵育时间为5h时，阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导质粒转染兔角膜内皮细胞的效率最高，可达到22.1％（图3）。
2.3脂质体浓度对转染效率的影响 在细胞融合度为81%～90％时进行基因转染，pEGFPN1质粒为0.6μg，脂质体分别取0.6，1.8，4.8μL，转染液的最终体积为600μL，48h后倒置荧光显微镜下观察转染效率的差别，在脂质体体积为1.8μL时转染效率最高（图4）。光学显微镜下见0.6，1.8μL 脂质体组及对照组细胞细胞呈三角形或多角形，胞浆透明，胞核居中，胞质未见浓缩，可见部分核分裂相，而4.8μL 脂质体组细胞形态发生改变，表现为细胞内颗粒增加，不同程度皱缩，但细胞质内少见空泡，胞质尚透明。
图1细胞融合度对转染效率的影响（略）
图2孵育时间对转染效率的影响（略）
图3最优化条件下绿色荧光蛋白的表达（略）
2.4脂质体与质粒DNA比例对转染效率的影响 在细胞融合度为81%～90％，每孔脂质体的量均为1.8μL时，按照脂质体与质粒DNA的比例分别为2∶1，3∶1，6∶1的比例进行角膜内皮细胞转染，48h后倒置荧光显微镜下观察转染效率的差别，发现在脂质体与质粒DNA比例为3∶1时细胞的转染效率最高（图5）。
图4脂质体浓度对转染效率的影响（略）
图5脂质体与DNA比率对转染效率的影响（略）
3 讨论
脂质体介导基因进入细胞的原理，是通过包绕DNA，共缩合成脂囊, 与细胞表面的唾液酸结合，经细胞的胞饮或受体介导的胞饮作用进入细胞内。在脂质体的磷脂成分中加入带有正电荷的磷脂分子,使其外部带正电荷,由于细胞膜及DNA 分子都带负电荷,故用阳离子脂质体作为基因的载体，既有利于包裹DNA 分子,也使脂质体易与细胞膜融合[2]。Masuda等[3]应用脂质体载体成功转染了大鼠角膜内皮细胞，报告基因在角膜内皮细胞的表达超过1mo。一种基因转染载体能否应用于临床，首先取决于其安全性。许多实验已经证明阳离子脂质体对培养的动物细胞很少或没有影响，反复应用也不会引起免疫反应[4,5]，然而，有些研究报道了高浓度的脂质体可以对细胞的增殖能力及细胞活性产生不利影响，这些影响与脂质体的化学构成有关，过高浓度的脂质体能够对细胞内的各种酶的代谢产生不利影响，从而导致细胞死亡[6]。同时不同组织来源的细胞也存在耐受性的差异，不同种类的阳离子脂质体的细胞毒性也存在较大差异。影响阳离子脂质体转染效率的因素较多，不同细胞相同脂质体或者同一类细胞不同脂质体的应用均可产生不同的转染效率，对于给定的细胞和阳离子脂质体而言，影响转染效率主要参数有：细胞融合度、脂质体与DNA 的质量比、脂质体/DNA复合物与细胞的比例、转染孵育时间以及培养基中是否含有血清等[7]。我们以培养的兔角膜内皮细胞为外源基因转移对象，采用lipofectamineTM2000阳离子脂质体为介导体, pEGFPN1用作报告基因以评价质粒DNA 的转染效率与表达水平。发现在一定范围内细胞密度的增加，使其对脂质体的耐受性也增加，转染后细胞受到的影响较小，但当细胞密度过高时，影响了脂质体复合物与细胞的充分接触，有效转染的细胞数目减少，转染效率反而降低；脂质体的浓度较低时，转染效率也低，脂质体浓度的上升，转染效率也随之增加，但超过一定的界限后，脂质体对细胞的毒性作用使转染效率明显的下降，转染效率随着脂质体浓度的增加呈非线性增加，当脂质体浓度超过一定限度时，转染效率会明显降低；脂质体与DNA的比率也影响其转染率，脂质体与DNA的质量比主要决定了所形成的复合物的电荷性质及稳定性，合适比例的脂质体/DNA可以使其形成的复合物稳定，增加其被细胞内吞的机会，当脂质体/DNA复合物比例不合适，游离的DNA会影响复合物的稳定性，而游离的脂质体则增加了对细胞的毒性，从而降低转染效率。转染孵育时间也是影响转染效率的一大参数，影响复合物能否与细胞充分吸附融合，完成外源基因的转入，转染时间太短使转染不充分，太长则细胞无法耐受脂质体的毒性作用，因此转染时间太短或太长都将影响转染效率。本实验结果表明, 阳离子脂质体载体LipofectamineTM2000能有效的将外源基因转入体外培养兔角膜内皮细胞，转染效率可达到15%～25%。在影响转染效率的参数中，当其它参数一定时，细胞融合度为81％～90％，脂质体与DNA 的质量比为3∶1，脂质体体积1.8μL（24孔板），转染孵育时间为5h时lipofectamineTM2000阳离子脂质体转染兔角膜内皮细胞效率最高。以上参数必须严格控制在一定范围之内，否则将影响转染效率及细胞的存活状态，甚至出现细胞脱落死亡。总之阳离子脂质体能有效介导质粒携带的外源基因在兔角膜内皮细胞的表达，在一定浓度范围内可以达到相当高的效率而不引起明显的细胞毒性。阳离子脂质体作为新型的非病毒载体，由于具有众多其他载体无法比拟的优点而成为一种很有前途的基因治疗手段，为角膜内皮细胞病变所致眼病的治疗开辟新的途径。
【参考文献】
1 Delepine P, Guillaume C, Floch V, et al. Cationic phosphonolipids as nonviral vectors: in vitro and in vivo applications. Pharm Sci2000;89(5):629638
2 Simberg D, Weiss A, Barenholz Y. Reversible mode of binding of serum proteins to DOTAP/cholesterol Lipoplexes: a possible explanation for intravenous lipofection efficiency. Hum Gene Ther2005;16(9):10871096
3 Masuda I, Matsuo T,Yasuda T. Gene transfer with Liposome to the introcular tissues by different routes of administration. Invest Ophthalmol Vis Sci1996;37(9):19141918
4 Gokhale PC, Zhang C, Newsome JT, et al. Pharmacokinetics, toxicity, and efficacy of endsmodified raf antisense oligodeoxyribonucleotide encapsulated in a novel cationic liposome. Clin Cancer Res2002;8(11):36113621
5韩梅,张劲松,孔珺,等. TGFβ1基因转染可抑制人晶状体上皮细胞增殖.国际眼科杂志 2007;7(2):357340
6 Choi JS, Lee EJ, Jang HS, et al. New cationic liposomes for gene transfer into mammalian cells with high efficiency and low toxicity. Bioconjug Chem2001;12(1):108115
7 GuillaumeGable C, Floch V. Cationic phosphonolipids as nonviral gene transfer agents in the lungs of mice. Hum Gene Ther 1998;9(16):23092319 上一页 [1] [2] |
