0引言

　　小梁网（trabecular meshwork, TM）临管区的邻管组织（juxta canalicular tissue, JCT）是形成房水流出阻力的重要部位，它是由小梁细胞（trabecular meshwork cells, TMCs）和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）组成的无定型组织层. ECM在细胞外的表达处于持续的重塑状态. 其合成和降解是调节房水流出阻力的一个重要环节［1］. 研究表明酸性富含胱氨酸分泌型蛋白（secreted protein acidic rich in cysteine，SPARC）在调节ECM的合成和降解中起着重要的作用. 它是一种细胞外基质相关糖蛋白的调节蛋白，又称为骨连蛋白，由3个结构域组成，Mr为43×103. 在多种组织中都发现了SPARC基因和其相关蛋白的表达，并起着调节细胞黏附、增殖、ECM的合成/转化以及ECM与细胞连接的作用［2］. 我们研究人眼TM组织和体外培养的人眼TMCs是否表达SPARC mRNA及其相应的SPARC蛋白，以进一步探讨改善房水流出、调节眼压（intraocular pressure, IOP）的机制以及原发性开角型青光眼（primary openangle glaucoma, POAG）的发病机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　DMEM培养基、Trizol总RNA提取试剂盒、RTPCR试剂盒、Taq酶均购自Gibico公司;BCA蛋白定量试剂盒（Pierce公司）；羊抗人SPARC pAb（Santa Gruz公司）；荧光素标记的兔抗山羊IgG（华美技术有限公司）. 人眼TM组织来自角膜移植供眼，皆为死后12 h以内剥离的TM组织，分别用于细胞培养及组织SPARC mRNA提取、RTPCR及SPARC蛋白WesternBlot检测.

　　1.2方法

　　1.2.1人眼TMCs体外培养行人眼TMCs体外培养组织学鉴定［3］，取传3代生长良好细胞用于实验.

　　1.2.2组织和细胞总mRNA提取取0.1 g TM组织，加1 mL TRIzol，匀浆，加氯仿、异丙醇沉淀RNA，离心，加DEPC水配制的乙醇， -20℃保存，选用A260 nm/A280 nm值近似2.0者用于RT反应. 细胞mRNA提取：冰上收集传3代TMCs（每份样品约3×106个细胞），加入1 mL TRIzol，注射器内反复抽提，其余同组织mRNA提取.

　　1.2.3组织和细胞SPARC mRNA RTPCR分析

　　1.2.3.1引物设计参考文献［4］的方法，扩增长度300 bp，内参照采用βactin，扩增长度451 bp.

　　1.2.3.2逆转录反应cDNA合成采用20 μL反应体系， 42℃温育15 min,99℃加热5 min,5℃ 5 min终止反应.

　　1.2.3.3RCR扩增采用20 μL反应体系. PCR方案：94℃预变性5 min，94℃变性60 s, 50℃退火60 s, 72℃延伸60 s,共35个循环.

　　1.2.3.4产物鉴定取5 μL PCR反应产物, 15 g/kg琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外灯下观察有无特异性条带.

　　1.2.4TM组织及TMCs SPARC蛋白WesternBlot分析分别取TM组织和传3代TMCs，加入膜蛋白裂解液，匀浆，离心，收集沉淀, -70℃保存待用. 稀释并定量细胞和组织蛋白样品，取样品50 μL，行SDSPAGE变性电泳，考马斯亮兰染色. PVDF转膜，脱脂牛奶封闭，依次加入第一抗体（羊抗人SPARC pAb，1∶500）、第二抗体（辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG，1∶500），DAB显色，扫描图像.

　　1.2.5免疫荧光细胞染色取生长于盖玻片的传3代人眼TMCs，固定，分别加一抗（山羊抗人antiSPARC IgG）及荧光素标记二抗（兔抗羊mAb）行免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜下观察细胞内SPARC表达. 采用PBS代替一抗孵育细胞，作为阴性对照.

　　2结果

　　2.1人眼TMCs培养TM组织贴壁后7～14 d即有细胞自边缘爬出，倒置显微镜下观察细胞成多角型、梭型，融合后为介于内皮与上皮细胞中间形态的扁椭圆形，透射电镜下可见胞体表面有突起及微绒毛，细胞器丰富，抗NSE、抗vimentin染色阳性，抗VIIIAg染色阴性.

　　2.2组织及细胞SPARC mRNA RTPCRPCR扩增35个循环所获产物电泳的结果可见βactin在451 bp处明显表达，TM组织和体外培养的人眼TMCs均可表达SPARC mRNA，在300 bp位置出现电泳条带（图1）.

　　2.3组织及细胞SPARC蛋白WesternBlot检测TM组织和体外培养的人眼TMCs均可表达SPARC蛋白，在Mr为43×103处出现明显蛋白条带，与纯SPARC蛋白电泳位置相同（图2）.

　　2.4TMCs抗SPARC免疫荧光染色抗SPARC染色呈阳性，可见胞质均匀荧光分布（图3），以PBS代替一抗的对照组胞质内无荧光显示.

　　3讨论

　　POAG的发病机制仍不清楚. 近年来研究表明TM组织，尤其是临管区ECM的异常堆积造成的房水引流阻力的增加，在POAG的发病中起着重要的作用. 前房灌注的方法发现黏多糖降解酶和基质金属蛋白酶（MMPs）能够显著降解ECM，从而产生调节IOP的作用. 骨连蛋白/SPARC是一种Mr为43×103分泌型糖蛋白，包括了血小板反应蛋白1和2，tenascins C和骨桥蛋白. SPARC在体内的两个基本功能为抗黏附和抗增殖作用. 原位杂交和免疫组化的研究表明很多种组织在重塑、正常发育和损伤修复过程中出现高水平的SPARC mRNA和SPARC蛋白的表达. 在眼部研究发现体外培养的角膜细胞能够表达SPARC mRNA,并合成相应的SPARC蛋白. 在角膜基质损伤和修复过程中SPARC合成和沉积增加，并将此作为角膜损伤修复的一个标志［5］. SPARC敲除的裸鼠表现为早期发生晶体浑浊，成熟迟缓，说明SPARC是维持正常发育和晶体透明的重要因素［6］. SPARC在对细胞及ECM的调节过程中表现为①抑制细胞伸展，松解局部连接，特别是ECM与细胞骨架中的肌动蛋白相连接的位点；②通过调节血浆纤溶酶原激活物抑制剂（PAI1）、纤维连接蛋白、层黏蛋白、血小板反应蛋白1的水平而刺激MMP1，2，9的生成，产生降解组织基底膜和ECM的作用. 但是SPARC mRNA及其相应蛋白在TM组织及TMCs是否有表达，以及相关的调节因素?  本实验结果显示TM组织和体外培养的TMCs均可表达SPARC mRNA，表现为在300 bp处出现一明显的mRNA 电泳带. 同时在TM组织和体外培养的TMCs中该mRNA可表达出相应的蛋白，WesternBlot检测发现在Mr为43×103处出现蛋白条带，这与Golembieski等［7］对SPARC的研究相符. 说明SPARC mRNA及其相应蛋白影响着TM组织临管区ECM的生成和降解，进而产生对房水流出及眼压IOP的调节. 我们实验中的人眼TM组织取自角膜移植供眼，供体年龄为30岁，因此无法得知SPARC的表达随年龄变化的改变情况. 已知ECM在TM 的堆积与年龄的增长有关，因此推测随年龄的增长SPARC的表达很可能会出现下调，而SPARC功能的改变会继发ECM代谢的异常，进而导致IOP升高. 但是在POAG时SPARC的表达是上调还是下调，程度如何，以及什么干预因子能够影响到其表达方面还需进一步研究.

　　【参考文献】

　　［1］ Bradley JM, Vranka J. Effect of matrix metalloproteinases activity on outflow in perfused human organ culture［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1998,39(13):2649-2658.

　　［2］ Brekken RA, Puolakkainen P, Graves DC, et al. Enhanced growth of tumors in SPARC null mice is associated with changes in the ECM［J］. J Clin Invest，2003, 111(4): 487-495.

　　［3］ 张文强，杨新光，郭斌，等. 压力对体外培养牛眼小梁细胞的影响［J］. 第四军医大学学报，2003,24(9):802-804.

　　［4］ Bradshaw AD, Sage  EH.Expression and purification of recombinant human SPARC produced by baculovirus［J］. Mol Cell Biol Res Commun， 2000, 3(6): 345-351.

　　［5］ Abe K, Hibino T, Mishima H, et al. The cytokine regulation of SPARC production by rabbit corneal epithelial cells and fibroblasts in vitro［J］. Cornea, 2004,23(2):172-179.

　　［6］ Sawhney RS. Expression and regulation of SPARC, fibronectin, and collagen IV by dexamethasone in lens epithelial cells［J］. Cell Biol Int， 2002,26(11): 971-983.

　　［7］ Golembieski WA, Rempel SA. cDNA array analysis of SPARCmodulated changes in glioma gene expression［J］. J Neurooncol， 2002,60(3):213-226.