【摘要】 目的 检测翼状胬肉中PCNA，Bcl2和Bax的表达水平，探讨PCNA，Bcl2和Bax在翼状胬肉发病中的作用。方法 采用免疫组化Elivision法检测20例翼状胬肉、10例正常结膜中的PCNA，Bcl2和Bax表达水平。结果 20例翼状胬肉中PCNA，Bcl2和Bax的阳性表达率分别为95%(19/20)，95%(19/20)和80%(16/20)，正常结膜中PCNA，Bcl2和Bax的阳性表达率分别为60%(6/10)，20%(2/10)和60%(6/10)。PCNA和Bcl2阳性表达两组间差异有显著意义（P<0.05），而Bax阳性表达两组间差异无显著意义（P>0.05）。结论 翼状胬肉的发生发展可能与PCNA的高表达和Bcl2与Bax表达失衡有关，可能是细胞异常增殖和凋亡失衡的共同结果。
【关键词】 PCNA；Bcl2；Bax；翼状胬肉；凋亡；免疫组织化学
翼状胬肉的发生，与紫外线照射及烟尘刺激有关，不仅影响外观,还可能损害视功能，其发病机制目前仍不十分清楚，近年来的研究发现，翼状胬肉是一组织增生性疾病，可能与细胞异常增殖和凋亡有关[1~2]，我们应用免疫组织化学Elivision法检测翼状胬肉组织中凋亡相关基因Bcl2，bax和表示细胞增殖指标的PCNA的表达，旨在探讨PCAN，Bcl2和bax基因产物在翼状胬肉发病机制中的作用。为翼状胬肉的化学药物治疗和基因治疗提供新依据。
1 材料和方法
1.1 一般资料
选择本院2004—2005年门诊及住院的20例翼状胬肉患者的手术标本。其中男11例，女9例，年龄39~64岁,病程15个月~12年；对照组为同期手术的10例正常结膜组织，年龄35~62岁，所有病例均无其他角膜、结膜疾患。标本经10%甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋。
1.2 方法
标本经固定后，常规脱水石蜡包埋，作3 μm 连续切片，分别进行HE染色和免疫组织化学染色。切片脱蜡至水化，3%过氧化氢孵育10 min ，消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗，PBS浸泡3×2 min，微波炉抗原修复（95~98 ℃），自然冷却至室温，加入即用型Bcl2，bax和1：100PCNA单克隆抗体，37 ℃ 孵育30 min，或4 ℃ 过夜，用普通小鼠IgG及PBS代替一抗作阴性及空白对照，PBS冲洗3×2 min，滴加增强剂（A），37 ℃ 孵育30 min，PBS冲洗3×2 min，滴加生物素聚合物（B），37 ℃ 孵育30 min，PBS 冲洗3×2 min。二氨基联苯胺显色，苏木素复染，中性树胶封片，显微镜观察照相。
1.3 染色结果判断
阳性细胞为呈棕黄色颗粒的阳性反应产物。每张切片在高倍显微镜下(200倍)随机选择5个视野，计算每个视野阳性细胞率，取平均值作为该标本的阳性细胞率。表达结果分为阴性（-）：无阳性细胞；弱阳性（+）：阳性细胞率<50%；强阳性（++）：切片中阳性细胞率>50%。
1.4 统计学方法
结果应用χ2检验进行统计学分析。所有数据在SPSS11.0统计软件上进行，以P<0.05为差异有显著性。第2期PCNA，Bcl2和Bax在翼状胬肉中的表达及其意义 颜美荣，等
2 结果
Bcl2，Bax和PCNA在翼状胬肉及正常结膜中的表达，由表1可见翼状胬肉中Bcl2和PCNA蛋白表达与正常结膜对比差异有显著性，而Bax蛋白表达在两组中则无统计学意义。光镜下观察，翼状胬肉上皮细胞中胞浆、胞膜呈棕黄色染色的细胞为Bcl2，Bax阳性细胞，片状分布于上皮层及上皮下纤维层，但主要见于上皮基底层。正常结膜中仅有2例见到Bcl2阳性表达，而Bax阳性表达较高。Bcl2在翼状胬肉中棕黄色颗粒可见于胞浆、胞膜内，呈均匀分布，但主要见于上皮基底层染色(×400)， 正常结膜中未见到Bcl2表达染色(×400)，Bax在翼状胬肉上皮中可见棕黄色颗粒均匀分布(×400)，正常结膜上皮中Bax阳性物质可见于胞浆、胞膜内。PCNA在翼状胬肉及正常结膜中的表达：光镜下观察，为棕黄色阳性颗粒位于细胞核，阳性细胞呈随机分布，静止期、进行期和复发性翼状胬肉的阳性细胞分布不同，静止期和正常结膜阳性细胞仅定位于上皮基底部，且呈散在分布，进行期阳性细胞增多，且向表层发展，复发性翼状胬肉阳性细胞明显增多，定位于上皮全层，染色最深。表1 Bcl2，Bax在翼状胬肉及正常结膜的表达情况（略）
3 讨论
细胞凋亡与肿瘤的关系是近年来的研究热点之一。细胞凋亡的失控是否导致翼状胬肉的发生发展, 备受眼科医生关注，成为目前的研究重点。Bcl2和Bax是该家族中的重要成员，它们主要通过线粒体途径参与凋亡调控，当细胞受到死亡信号刺激，与Bcl2蛋白相结合的蛋白就会被置换出来，线粒体膜通透性增加，释放出一系列物质，最终导致细胞死亡[3~5]。翼状胬肉是一慢性增生性眼病。病理学研究表明，翼状胬肉组织中含有大量增生的血管和弹性纤维与胶原纤维的增生和变性，以及球结膜上皮细胞的异常增殖。临床表现为新生的组织不断生长、增厚，并逐渐侵入角膜，此特点与肿瘤发生发展的重要原因细胞异常增殖和凋亡失衡相似。近年来关于翼状胬肉发病机制的研究已取得较大进展，但学说颇多，确切机制至今尚未阐明，我们通过对PCNA，Bcl2和Bax在翼状胬肉表达的观察，旨在进一步探讨其发病机制。PCNA是真核细胞DNA合成所必需的一种核蛋白其相对分子质量为36 000，是DNA多聚酶的辅助蛋白，是细胞DNA合成期的必需物质。在静止细胞中PCNA含量很少，G1晚期开始增加，S期达到高峰，G2期下降，M期测不到。因此认为 PCNA 与细胞增殖活动密切相关，可作为一种准确、简便、直观研究评价细胞增殖状态的重要指标，我们的研究结果显示翼状胬肉中PCNA 表达增高，明显高于正常结膜，提示翼状胬肉内存在明显的细胞增殖和活跃的物质合成。可能与翼状胬肉的发生发展有关[6~7]。Bcl2和Bax是凋亡密切相关的基因，Bcl2是最为熟悉的抑凋亡基因，而Bax则是促凋亡基因，二者的比例决定细胞接受凋亡信号后的存活与否。本实验中，Bcl2在翼状胬肉中全部表达阳性，且多见于上皮层，尤其是基底层，而正常结膜全部表达阴性；Bax在翼状胬肉与结膜中的表达无显著差异，提示在翼状胬肉中Bcl2和Bax表达失衡,过量表达的的Bcl2抑制了Bax的作用，使得增生、分化活跃的上皮基底细胞正常的凋亡受到抑制。导致了翼状胬肉的发生发展。我们的研究结果发现，正常结膜存在着Bax基因蛋白的表达，组织的细胞增殖与凋亡处于平衡中;在翼状胬肉中，Bcl2与Bax的表达无相关，表明翼状胬肉中凋亡抑制基因的启动以及异常的增殖并非是组织凋亡的自身平衡效应，而是受刺激后产生的病理反应，可能是由于紫外线照射、风沙、粉尘等刺激因素引起球结膜的蛋白变形及细胞因子的异常分泌，直接或间接通过某种信号启动凋亡抑制基因，使得上皮基底细胞正常的凋亡受到抑制，同时外界的刺激及其分泌的细胞因子引起的大量细胞增殖。正如肿瘤一样，它不仅仅是通过细胞增殖引起，同时也是细胞凋亡受抑制造成了细胞堆积。因此,我们认为，细胞的失控性增生与凋亡异常的共同作用在翼状胬肉发生发展中有重要意义。进一步研究如何对细胞增殖与凋亡的有效调控对翼状胬肉的预防、治疗及防止术后复发有重要的意义。
【参考文献】
[1\] 郑卫东,徐国兴,胡建章,等.翼状胬肉中细胞增殖与凋亡相关基因蛋白的表达及其意义\[J\].中国实用眼科杂志,2003,21(9):649-651.
[2\] Tan D T H, Tang W Y,Liu Y P,et al. Apoptosis and apoptosis related gene expressionin normal conjunctive and pterygium\[J\]. Br J Ophthalmol, 2000,84:212-216.
[3\] 王海燕,黄爱民,高美钦.Survivin, Bcl2和Bax蛋白在乳腺癌中的表达及其意义\[J\].解剖学杂志,2006,29(1):61-64.
[4\] Panasiuk A,Dzieciol J,Panasiuk B,et al. Expression of p53,Bax and Bcl2 proteins in hepatocytes in non-alcoholic fatty liver disease\[J\]. World J Gastroenterol,2006,12(38):6198-6202.
[5\] Condon L T,Ashman J N,Ell S R,et al.Overexpression of Bcl-2 in squamous cell carcinoma of the larynx: a marker of radioresistance\[J\].Int J Cancer,2002,100(4):472-475.
[6\] Ueda Y, Kanazawa S, Kitaoka T,et al.Immunohistochemical study of p53, p21 and PCNA in pterygium\[J\].Acta Histochem,2001,103(2):159-165.
[7\] Tsironi S, Ioachim E, Machera M,et al. Presence and possible significance of immunohistochemically demonstrable metallothionein expression in pterygium versus pinguecula and normal conjunctiva\[J\]. Eye,2001,15(Pt 1):89-96. |
