作者：柏丽娜 张学东 作者单位：重庆医科大学附属第一医院 眼科，重庆 400016
【摘要】 目的 分析重庆地区汉族人群脂联素基因SNP +276 G/T的基因型分布，探讨该多态性与糖尿病性视网膜病变的相关关系。方法 在重庆地区汉族人群中选取100例2型糖尿病患者、98例糖尿病性视网膜病变患者和69例正常对照组，采用聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性（PCR-RFLP）方法检测脂联素基因SNP+276的多态性位点，比较各组基因型及等位基因频率分布。结果 ①脂联素基因SNP+276在重庆地区汉族人群中存在三种基因型（G/G、G/T、 T/T），对照组的分布频率分别为42.0％、47.8％、10.1％，糖尿病无视网膜病变组的分布频率分别为53.0％、39.0％、8.0％，糖尿病性视网膜病变组的分布频率分别为42.9％、37.8％、19.4％。②对照组、糖尿病无视网膜病变组及糖尿病性视网膜病变组三组脂联素基因SNP+276基因型分布频率比较差异无统计学意义。③对照组、糖尿病无视网膜病变组及糖尿病性视网膜病变组的G等位基因频率分别为65.9％、72.5％、61.7％；三组脂联素基因SNP+276等位基因的分布频率比较差异无统计学意义。结论 脂联素基因SNP+276多态性位点与重庆地区汉族人群中糖尿病性视网膜病变的发生无明显相关性。
【关键词】 脂联素 限制性片段长度多态性 糖尿病性视网膜病变
脂联素是新近发现的，由脂肪细胞分泌的蛋白质，具有改善胰岛素抵抗、抗动脉粥样硬化及抗炎的作用[1]。国外学者在2型糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者中发现，有视网膜病变者血浆脂联素水平较无视网膜病变患者显著降低[2]，提示脂联素在糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）的发生、发展中起了一定作用。同时研究表明，脂联素基因SNP+276多态性与肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病相关[3]。本研究从侯选基因的角度出发，分析重庆地区汉族人群脂联素基因SNP+276 G/T的基因型分布，探讨该多态性与糖尿病性视网膜病变的相关关系，进而寻找糖尿病性视网膜病变新的易感基因，为糖尿病性视网膜病变易感人群的一级预防提供遗传学依据。
1 对象和方法
1.1 研究对象 在重庆地区汉族人群中，选择有2个或2个以上2型糖尿病患者的157个家系进行家系调查，对先证者的父母﹑同胞﹑子代进行口服75 g葡萄糖耐量实验（OGTT）。根据糖耐量结果，按照1999年WHO与美国糖尿病协会(ADA)认可的糖尿病诊断及分型标准进行诊断有无糖尿病。其中空腹静脉血浆葡萄糖浓度≥7.0 mmol/L（126 mg/dl）或糖耐量试验（OGTT）口服75 g葡萄糖后2 h静脉血浆葡萄糖浓度≥11.1 mmol/L诊断为糖尿病。对所有诊断为糖尿病的患者进行充分散瞳后详细检查眼底，必要时做荧光素钠眼底血管造影，按照第三届全国眼科会议通过的诊断标准，确定被检者有无糖尿病性视网膜病变。选取正常对照组患者69例，其中男33例，女36例，平均年龄(54.90±14.08)岁，体重指数（23.07±3.23）kg/m2。糖尿病患者无视网膜病变者100例，其中男44例，女56例，平均年龄(55.16±10.83)岁，体重指数(24.28±3.11)kg/m2。糖尿病伴视网膜病变者98例，其中男39例，女59例，平均年龄(61.67±11.84)岁，体重指数(24.06±3.88)kg/m2。各组中每例对象均来自不同的家系，个体之间无血缘关系。所有对象心、肝、肾功能正常，且均来自重庆地区汉族人群。
1.2 标本采集 抽取受试者空腹静脉血5 ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，3000 r/min离心10 min，分离白细胞层，用于提取外周血基因组DNA。
1.3 方法
1.3.1 DNA的制备及扩增 按照美国Axyprep 生物公司提供的全血基因组DNA微量提取试剂盒说明，进行DNA的抽提。从Genebank中查取人APM-1基因序列，用Primer 5软件进行在线引物设计，合成片段长452 bp。上游引物为5’ GAT GGA CGG AGT CCT TTG TAG GTC 3’，下游引物为5’ CCA AAT CAC TTC AGG TTG CTT ATG 3’。PCR反应体系：DNA模板4 ?滋l，10×Taq Buffer 2.5 ?滋l，d NTP Mixture 0.5 ?滋l，Taq酶0.5 ?滋l，上下游引物各1 ?滋l，dd H2O 补足25 ?滋l。PCR反应条件：94℃预变性 3 min，95℃变性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸 1 min，32个循环后72℃延伸10 min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下检测扩增结果。
1.3.2 多态性基因分型 SNP+276G→T多态性检测均采用PCR-RFLP方法。PCR产物用Bsm Ⅰ内切酶经37℃水浴16 h消化后，行2％琼脂糖凝胶电泳，即得到该SNP的基因分型结果。
1.4 统计学方法 计算Hardy-Weinberg 平衡以判断样本的代表性。实验数据中计量资料数据以x±s表示，所有统计学分析均采用SPSS11.5分析软件。各组间一般临床资料比较采用方差分析（非正态分布的数据经对数转换后比较），两组间的比较采用SNK法。SNP 位点的等位基因频率在组间的差异分析采用χ2检验。
2 结果
2.1 三种基因型酶切产物电泳结果（见图1） 酶切产物经2％琼脂糖凝胶电泳分离后，仅出现452 bp条带的基因型为纯合子TT，同时出现82 bp、370 bp条带的基因型为纯合子GG，同时出现82 bp、370 bp、452 bp的基因型为杂合子GT。
2.2 三组等位基因及基因型分布频率（见表1） 各组等位基因及基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。从表1中可见本研究人群中糖尿病和糖尿病性视网膜病变组脂联素基因SNP+276的基因型分布以GG为主。根据等位基因的计算公式算出各组中G、T等位基因的频率，可见三组均以G等位基因常见。各组间基因型频率及等位基因频率差异均无统计学意义（χ2=8.153，P=0.086；χ2=5.247，P=0.073）。
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