【摘要】 探讨干扰RNA（siRNA）沉默缺氧培养下人的视网膜色素上皮细胞（hRPE）中整合素连接激酶（ILK）的表达及其对缺氧诱导因子1α（HIF1α）表达的影响。
方法：CoCl2建立hRPE细胞的化学缺氧模型，Western blot和RTPCR方法半定量检测不同缺氧时间（0，6，12，24，48h）hRPE细胞中ILK、HIF1α蛋白及其mRNA的表达；阳离子脂质体转染ILK的干扰片段抑制缺氧24h hRPE细胞中ILK的表达，同上方法检测转染后缺氧24h hRPE细胞中ILK的表达及其对HIF1α表达的影响。
结果：ILK表达于正常及缺氧培养的hRPE细胞中。随着hRPE细胞缺氧时间的延长，在蛋白和mRNA水平ILK、HIF1α都呈现逐渐增加的表达趋势。siRNA抑制ILK在缺氧24h hRPE细胞中的表达，同时显著抑制了HIF1α的表达，较阴性对照组、单纯脂质体组有显著差异（P<0.01）。
结论：ILK可以通过HIF途径应答RPE细胞的缺氧反应。
【关键词】 缺氧 RNA干扰
0引言
缺氧是缺血缺氧性视网膜脉络膜病变发生的关键。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE)细胞在其病理过程中起着不可忽视的作用。整合素连接激酶(integrim linked kinase, ILK)是一种新发现的丝氨酸/苏氨酸激酶，能够参与整合素、生长因子、WNT等信号传导通路，与细胞的持续增殖、粘附性丧失、迁移以及血管的生成都有密切的联系，新的研究发现ILK也可作为低氧应激有关众多胞内分子的上游应答者，在内皮细胞中应答缺氧。我们通过CoCl2建立hRPE细胞的化学缺氧模型来探讨缺氧培养hRPE细胞中ILK的表达及对缺氧诱导因子HIF1α表达的影响。
1材料和方法
1.1材料
DMEM/F12细胞培养基，OptiMEMI无血清培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；Trizol，逆转录试剂盒，TAG酶均购自北京中杉公司，蛋白提取试剂盒购自赛百胜公司。PCR引物由上海基康生物公司合成，lipofectamine2000，siRNA干扰片段由广州瑞博公司设计合成。
DAB试剂盒、兔抗ILK多克隆抗体，鼠抗HIF1α的mAb(美国Santa Cruz公司)。角膜移植的供体眼，于死亡后12h之内进行分离培养，以5×107/L细胞密度接种6孔培养板中培养，逐步扩增至常规培养传代。抗人角蛋白抗体免疫细胞化学染色进行细胞鉴定，获得纯度高达100%的RPE细胞（图1）[1,2]。
1.2方法
hRPE取3～6代细胞用于实验，用含150μmol/L CoCl2的培养基模拟化学缺氧培养。转染前将用于实验的hRPE细胞共分为5组：分别为含150μmol/L CoCl2的培养基继续培养6，12，24，48h，另设一个不含CoCl2的100mL/L FBS常规条件培养的对照组，即缺氧0h组；hRPE细胞再分为阴性对照、阳性对照、单纯脂质体、ILKsiRNA干扰组转染后继续缺氧培养24h。
1.2.1 Western blot免疫印记
根据上述分组收集细胞，提取细胞总蛋白,Bradford法测定样本蛋白质浓度,制胶（12％、5％的分离胶，）,在积存胶加样孔内加入等量蛋白质样本和标志物电泳转膜，TBST (5%脱脂奶粉!10mmol/L Tris!100mmol/L NaCl，0.1%Tween20,pH7.5)37°封闭1h后再与1∶500的一抗(兔抗ILK、鼠抗HIF1α抗体) 4℃孵育过夜，次日再用TBST洗膜,加入辣根过氧化物酶偶联的二抗IgG (1∶800稀释),室温摇动2h,再用TBST洗膜,最后按照说明要求加入ECL试剂,室温下曝光。照相,分析蛋白条带积分吸光度(A)值，重复时完全一致。
1.2.2 RTPCR半定量检测目的基因的表达
收集如上分组培养细胞，按Trizol操作说明.分别提取总RNA紫外分光光度计定量，调整RNA质量浓度，内参选用人的βactin。RNA样品经逆转录反应合成cDNA第一链，然后进行PCR扩增。ILK引物序列5’GGCTCAGGATTTTCTCGCA 3’ 5’CTGCTGAGCGTCTGTTTGTG3’，399bp；HIF1ɑ5’CCCAGATTCAGGATCAGACAC3’，5’TTGGGATATAGGGAGCTAACATC3’ ，228bp内参照βactin：5’TGGATGATGATATCGCCGC3’5’GTAGATGGGCACAGTGTGGGT3’，501bp。25μL反应体系进行PCR扩增，产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳(含0.5g/L溴化乙腚)，拍照，使用GelPro Analyzer 4.0分析软件测量目的基因及内参βactin的积分吸光度(A)值，并分别计算每条带与内参的比值，即相对积分吸光度值(relative integral absorbance, RIA)，作为目的基因的相对表达量。表1 hRPE细胞转染后缺氧24hILK及HIF1α的蛋白（灰度值±s）及mRNA表达（略）
1.2.3细胞基因转染
根据GenBank数据库提供的人的:ILK全长基因(GenBank No.)的靶序列mRNA：（5’3’）TGGACACCGTGATATTGTA；设计合成siRNA干扰序列：正义链（5’3’）uggacaccgugauauugua dTdT，反义链（3’5’）dTdT accuguggcacuauaaca u。胰酶消化处于对数生长期的细胞，用无抗生素DMEM/F12新鲜生长培养基稀释细胞后传代六孔板，在无抗生素的培养基中培养24h后，细胞融合率达60％时开始转染。操作按lipofectamine2000试剂说明进行，分别用OptiMEMI培养基稀释siRNA和转染试剂。以50nmol/L浓度进行转染。转染后6h换成含150μmol/L CoCl2的培养基继续缺氧培养24h，阴性对照以FAM荧光标记、阳性对照加入βactin干扰片段、单纯脂质体组不加入siRNA，其他与转染组处理相同。
统计学处理：计量资料以(±s）表示,差异显著性采用方差分析及独立样本的t检验,统计运算采用SPSS11.5 for Windows统计软件进行处理,以P<0.05作为差异有显著意义。
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