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2结果
2.1转染前
ILK在正常细胞培养条件下蛋白表达为609.76±34.08，缺氧6h后明显升高至793.13±21.67，持续高表达至缺氧48h；正常培养条件下hRPE细胞中未检测到HIF1α的蛋白表达，缺氧6h表达显著的升高至817.76±34.08，并持续高表达至缺氧24h，缺氧6，12，24，48h各组细胞中ILK,HIF1α表达与正常对照组有显著差异，P<0.01；RTPCR显示在正常培养条件下hRPE细胞存在ILK,HIF1α的转录，随着缺氧时间延长两者呈现了相同的转录增加趋势。ILKsiRNA可成功转染hRPE细胞，荧光显微镜下观察转染率大于80％（图2），符合实验要求。阳性对照βactin被显著抑制，表明转染体系正常，以siRNA转染hRPE细胞后缺氧24h，ILK及HIF1α的表达结果见表1。ILKsiRNA转染显著抑制了ILK的表达，抑制了HIF1α的蛋白及mRNA的表达。转染组ILK及HIF1α的蛋白及mRNA的表达较无关转染组及单纯脂质体组P﹤0.01，均有显著差异。无关对照组与脂质体组无显著差异P>0.05。
3讨论
对蛋白质的Ser/ Thr或Tyr的转译后修饰是细胞生命活动的核心调控机制。而细胞内蛋白质的磷酸化水平是由蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性协同控制的。胞内激酶的一个重要作用是参加信号传导，通过信号传导细胞能够对来自外界的信息做出功能性的回应。整合素连接激酶( integrim linked kinase, ILK)是一个Ser/ Thr蛋白激酶。它能介导细胞与胞外基质的相互作用并通过下游底物蛋白激酶B和糖原合成酶激酶3将胞外信号向下游传递，其在血管生成、细胞凋亡、细胞迁移方面都发挥着重要的作用，可在部分上皮细胞中呈现高表达。视网膜新生血管( retinal neovascularization,RNV)及脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)疾病的发生和进展中，视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE)在其病理过程中起着关键的作用。HIF1是细胞对氧浓度改变的一系列自适应反应中重要的调节因子，是缺氧诱导基因转录的关键环节，也是缺氧诱导基因转录过程中缺氧信息传递的共同通路?HIF1是由120kDa的亚基和91～94kDa的β亚基构成异二聚体，HIF1α是HIF 1的调节及活性亚基，可被缺氧诱导表达[3,4]。
本实验Western blot显示人的视网膜色素上皮存在ILK的基础表达，随着缺氧时间的延长表达升高，同时伴随着HIF1α的表达上调，RTPCR显示其转录水平也是同步上调，为了验证在hRPE细胞中是否存在ILK的活化上调HIF1α的表达，从而应答缺氧，导致血管新生。运用小分子RNA干扰（siRNA）通过瞬时转染使缺氧培养条件下的人RPE细胞的ILK基因表达被沉默，结果导致了一个显著的HIF1α的下调，表现在蛋白及转录水平。证实在视网膜色素上皮中ILK为HIF1α上游的一个调控点。Tan等[5]也为检验ILK的抑制效果用高表达ILK的活性和快速组成VEGF的PC3 and DU145前列腺癌细胞，通过瞬时表达负性ILK，或是给与小分子的ILK的抑制剂，VEGF和它的主要的转录活性因子HIF1α均应答了ilk的抑制，这与本实验结果一致。因为ILK是PI3K 依赖性的，而下游靶点是PKB/Akt，它是可能通过调节PKB活化而提高HIF lα的稳定性表达。另外，因为HIF1α转录调节是通过mTOR/ FRAP,来调节的，它是Akt的一个下游靶基因，ILK通过调节Akt活性进而调节mTOR/ FRAP,来调节HIF1α的转录水平[6]。研究发现，ILK是PKB活化的一个必要的上游调节子，运用双链RNA干扰(siRNA)和条件性基因敲除技术沉默ILK基因后，几乎可完全阻断PKB的Ser 473磷酸化, PKB活性显著受阻，从而可判定ILK作为一个低氧幸存信号的参与者[7,8]。在体外神经胶质瘤细胞的侵袭能力及新生血管形成的研究中同样发现ILK是基本的，对于HIF的表达和作为结果产物的VEGF的表达存在着上游调控的作用，通过QLT0267使ILK的功能失活结果导致跟着akt和mTOR/FRAP的磷酸化的降低，HIF的蛋白表达水平下降。在许多类型的肿瘤细胞凋亡及侵袭的研究中均发现抑制ILK的活性会抑制PKB/Akt serine473 的磷酸化及其活性，但是在正常的非致瘤性的成纤维细胞中不出现其调节PKB/Akt的磷酸化和活性的效应。由此可见，视网膜色素细胞中ILK在缺氧条件下对刺激HIF1α的表达扮演着关键的角色，通过阻断ILK的活性或是阻断ILK的信号途径可以为缺血、缺氧性视网膜脉络膜病变提供新的治疗思路。
【参考文献】
1王雨生，严密，杨抚华.视网膜色素上皮细胞培养技术及其应用.中华眼底病杂志1994;10( 2) : I 24128
2 Hudson CC, Liu M, Chiang GG, Gtterness DM, et al. Regulatiom of hypoxia inducible factor la1pha expression and funtion by the mammlion target of rapamycin. Mol Cell Biol 2002;22(20):70047014
3熊宇,夏晓波,许惠卓,等. RNA抑制小鼠视网膜HIF1α蛋白质的表达.国际眼科杂志2007;7(2):361364
4李雯霖,姜德咏,郭丽花,等.葛根素抑制糖基化终产物诱导的人视网膜色素上皮细胞增殖及低氧诱导因子1a的表达.国际眼科杂志2006;6(3):580583
5 Tan C, CruetHennequart S, Troussard A, et al. Role of Integrinlinked Kinase in Angiogenesis Through the Regulation of HIF1a and VEGF Expression. Mol Cell Proteomics 2006;2(9):702
6 Abboud ER, Coffelt SB, Figueroa YG, et al. Regulation of tumor angiogenesis by integrin－linked kinase（ILK）. Cancer Cell 2004；5（1）：7990
7 Koul D, Shen R, Bergh S, et al. Integrin by integrinlinked kinase:a hypoxiainduced antiapoptic factor exploited cancer cells. Mol Cancer Ther 2007;30(1):113122 上一页 [1] [2] |
