摘 要 目的：观察体外培养人视网膜色素上皮细胞（RPE）免疫组化特征.
方法：取第1代、第3～6代RPE，以间接免疫荧光方法比较角蛋白、波形蛋白、肌动蛋白、VⅢ因子和GFAP,HAM45等6种蛋白表达的特征.
结果：与对照组相比，传代培养的人RPE角蛋白、波形蛋白表达呈阳性；随传代次数增多，角蛋白表达强度无明显变化，波形蛋白表达逐渐增强；肌动蛋白、VⅢ因子、神经纤维酸性蛋白（GFAP）、HMB45呈阴性.
结论:体外培养可获得纯化、活性好的RPE.本中心建立的人RPE有限细胞系稳定表达角蛋白，并可表达波形蛋白.
关键词：色素上皮 眼 细胞，培养的 中间丝 免疫荧光技术，间接
0 引言
视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞为眼内最重要的一种细胞，行使多样的生理功能，多种视网膜疾病的病因为RPE最初起源［1］.RPE增生可引起增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy，PVR）；RPE萎缩或功能减退与视网膜色素变性、老年黄斑变性密切相关［2～4］.因此，体外培养纯化的RPE细胞对基础研究和临床应用具有十分重要的价值.细胞骨架中的中间丝，为多数细胞的重要蛋白质成分，其分布具有组织特异性，并且比较稳定，依此可判定正常和肿瘤组织的胚胎起源.我们以中间丝为主，采用间接免疫荧光方法对我中心建立的RPE细胞有限细胞系的纯度及数种蛋白表达的免疫组化特性进行了观察.
1 材料和方法
1.1 材料 RPE细胞的培养：从意外死亡的健康成年男性获取供体眼球,于死亡后12h内进行分离、培养RPE［5］，方法是：将眼球角膜向上置于特制的眼球托上，自赤道部环形剪开眼球壁，去掉眼前节及部分玻璃体.体视显微镜下仔细分离视网膜神经上皮层，于视盘周围将其剪除，制成RPE杯.D-Hanks液漂洗RPE杯2次，加入2.5mL/L胰蛋白酶和0.2mL/LEDTA混合液，37℃消化1h.用吸管轻轻吹打使细胞脱落，将含RPE细胞的消化液移入预先加有200mL/L小牛血清DMEM培养液（另含D-葡萄糖4500mg/L和庆大霉素10×104U/L，pH7.2～7.4）的离心管中，终止胰酶作用.重复消化1～2次，将RPE细胞悬液离心8min，1000r/min.弃上清，用培养液调整细胞密度至5×107/L后，接种于培养瓶，37℃,50mL/LCO2培养箱培养.RPE传代培养同文献［6］，选第1代、第3～6代细胞用于实验.人角朊细胞、成纤维细胞培养参见参考文献［7，8］.兔抗人细胞角蛋白多克隆抗体，兔抗人VⅢ因子多克隆抗体，兔抗人GFAP多克隆抗体及鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体为Dako公司产品；鼠抗人波形蛋白单克隆抗体为Sigma公司产品，鼠抗人HMB45单克隆抗体为Zymed公司产品，羊抗兔、羊抗鼠IgG荧光抗体为SantaCruz公司产品.
1.2 方法 18mm×18mm的盖玻片平铺于直径10cm的培养皿中，将200μL、密度为4×107/LRPE细胞悬液滴于盖片中央，于培养箱培养，4h～5h后补足培养液.细胞近满时，将盖片捞出，PBS漂洗2～3次，冰丙酮固定10min～15min，自然干燥后于4℃密闭保存.细胞爬片经PBS漂洗后入甲醇3mL/LH2O230min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS漂洗2次后，入0.3mL/LTritonX-10015min；PBS漂洗，加入1∶50稀释的一抗，湿盒4℃过夜；PBS漂洗，加1∶50稀释的荧光抗体，于室温湿盒孵育5h，PBS漂洗，荧光显微镜观察.用PBS代替第一抗体作阴性对照，并作自发荧光试验.人角朊细胞爬片，人成纤维细胞爬片分别作为角蛋白、波形蛋白阳性对照.
2 结果
刚分离的hRPE细胞呈圆形,大小均一，充满黑色素粒，看不见细胞核.2d～4d后，大部分细胞贴壁变扁平，呈多边形；细胞伸出伪足，呈集落样生长；多数细胞显露清晰透明的细胞核，并见双核或多核细胞.14d～28d细胞铺满，呈致密排列的六边形或多边形（Fig1）.传代培养的RPE细胞形态不很规则，呈梭形或不规则形，HE染色显示胞核内核仁丰富（Fig2）.透射电镜观察细胞周围可见大量绒毛，胞膜完整.核膜双层结构清楚，有1～3个核仁.染色较深的小块状异染色质主要分布于核膜内侧及核仁周围；常染色质位于核中央，染色浅.胞浆内线粒体、内质网及高尔基体等细胞器丰富，偶见黑色素粒（Fig3）.
图 1 原代培养的hRPE细胞铺满期光镜观察
Fig 1 Confluent primary cultured hRPE cells under light microscope ×100
图 2 第4次传代培养hRPE细胞铺满期光镜（上）/HE染色（下）
Fig 2 4-passage confluent hRPE cells ×100 (upper)/HE ×200 (lower)
图 3 第3次传代培养hRPE细胞透射电镜观察
Fig 3 3-passage hRPE cells under transmission EM ×4 000
第1代、第3～6代RPE细胞角蛋白表达呈强阳性，荧光遍及胞质；阳性对照人角朊细胞为强阳性；第1代RPE细胞波形蛋白表达为阴性或弱阳性，表现为模糊的细胞轮廓或微弱的黄绿色荧光着染，第3～6代RPE细胞波形蛋白表达为阳性，在胞质中略呈网状，核周呈浓集荧光，阳性对照人成纤维细胞波形蛋白表达为强阳性，可见致密黄绿色荧光遍布胞质，部分为网状着染.hRPE细胞肌动蛋白、VⅢ因子、GFAP,HMB45表达均为阴性（Fig4～9,Tab1).
图 4 第4次传代培养hRPE细胞角蛋白阳性表达
Fig 4 Keratin of IMF in 4-passage hRPE cells: moderate staining in cytoplasm ×400
图 5 传代培养人角朊细胞角蛋白阳性表达
Fig 5 Keratin of IMF in subcultured human keratinocytes ×400
图 6 第4次传代培养hRPE细胞波形蛋白阳性表达
Fig 6 Vimentin of IMF in 4-passage hRPE:obvious reticulate fibre in cytoplasm ×400
图 7 传代培养人成纤维细胞波形蛋白阳性表达
Fig 7 Vimentin of IMF in human fiberblast: intensive and marked fluorescence in cytoplasm ×400
图 8 第1代培养hRPE细胞波形蛋白弱阳性
Fig 8 Vimentin of IMF in 1-passage hRPE cells: trace staining ×400
图 9 传代培养人角朊细胞波形蛋白阳性表达
Fig 9 IMF in subcultured human keratinocytes ×400
表 1 RPE和对照细胞标记强度
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