作者：袁向亮，赵惠君，蒋黎敏，徐，袁晓军，汤静燕，沈立松
【摘要】 本研究检测视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein, pRb）在不同类型儿童急性白血病细胞中的表达，并探讨其表达水平与细胞周期、危险度、微小残留病（minimal residual disease, MRD）监测、预后等临床诊断治疗监测指标的关系。对89例初发小儿急性白血病患者（包括25例AML, 10例T-ALL, 54例B-ALL）及7例正常对照骨髓标本，采用流式细胞术（FCM）分别检测治疗前后视网膜母细胞瘤蛋白的表达情况，并对部分病例进行细胞周期分析。 结果表明： ①流式细胞术检测pRb的表达准确直观；②在各种类型的急性白血病中pRb的高水平表达具有普遍性，同一患儿白血病细胞pRb的表达明显高于非白血病细胞，在不同类型的急性白血病中pRb均有缺失表达；③ pRb的表达水平与白血病细胞的细胞循环周期可能存在一定的相关性，pRb表达阳性的B-ALL中处于G1期的白血病细胞数显著高于pRb表达阴性的病例(92% vs 77%)；④ B-ALL中，MRD阳性组pRb的表达量明显低于阴性组，且差值有统计学意义（P<0.05），并且治疗前后非白血病细胞的pRb表达水平是稳定的；⑤ pRb的表达量与B-ALL早期治疗预后之间存在一定相关性，B-ALL预后不良组pRb的表达量低于预后良好组（P<005）。结论： pRb在儿童急性白血病细胞中存在高水平表达或缺失等异常形式的表达差异，pRb的表达与白血病细胞的细胞周期、MRD监测、早期治疗反应的预后评价等存在相关性，对于B-ALL的治疗监测及预后评估具有指导意义。
【关键词】 急性白血病； 儿童急性白血病；视网膜母细胞瘤蛋白； MRD监测
Expression of Retinoblastoma Protein in Child Acute Leukemia Cells and Its Clinical Significance
AbstractThe research was aimed to detect the expression levels of retinoblastoma protein (pRb) in child acute leukemia cells, and to explore its possible association with leukemia cells cycle, the risk of disease, minimal residual disease (MRD) monitoring and prognosis of B-ALL. Flow cytometry (FCM) was used to detect the expression of pRb in 89 cases of acute leukemia (including 25 AML, 10 T-ALL and 54 B-ALL) and bone marrows from 7 normal children (control group). Meanwhile the cell cycle in some cases was analyzed . The results showed that (1) the FCM could accurately detect the expression of pRb in acute leukemia cells; (2) the high level of pRb expression was frequent in all types of child acute leukemias. In the same case, the expression of pRb was significantly increased in leukemia cells when compared with non-leukemia cells. And no detectable pRb protein was found in partial cases of acute leukemia; (3) there was a close relation between expression of pRb and the cell cycle of leukemia cells, the number of G1 phase cells in pRb positive case of B-ALL was more than that in pRb negative case (92% vs 77%); (4) in B-ALL, the level of pRb expression in MRD positive group was significantly lower than that in MRD negative group (P<0.05), but pRb expression was stable in non-leukemia cells during therapy; (5) pRb expression was related to the early response to therapy in B-ALL, the expression of pRb was significantly increased in sensitive group when compared with insensitive group (P<005). It is concluded that high level or absence of pRb expression can be found in child acute leukemia cells. The expression of pRb is positively related to cell cycle of leukemia cells, MRD monitoring and the early response to therapy. In short, the detection of pRb expression level can guide the therapy and the evaluation of prognosis in B-ALL.
Key worksacute leukemia; child acute leukeima; retinoblastoma protein; MRD monitor
视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein, pRb）作为细胞周期的重要调控因子以及它的基因作为第一个被克隆的抑癌基因在视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌等多种肿瘤中异常表达、缺失或突变等，在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。以往研究表明，急性白血病细胞中pRb的表达状态与白血病细胞对化疗的敏感性及患者生存期有关［1，2］。因此研究pRb的表达情况对阐明白血病的发病机制及对于白血病的诊断、治疗监测具有重要意义。本研究采用流式细胞术对89例小儿急性白血病患者（包括AML、T-ALL、B-ALL）标本的检测，研究pRb蛋白在急性白血病的表达情况以及pRb蛋白的表达水平及其与细胞周期、急性B淋巴系白血病危险度分期、微小残留病（minimal residual disease, MRD）监测和治疗预后的相关性。
材料和方法
病例
2003年2月—2004年11月，上海儿童医学中心收治的初发急性白血病患儿89例。在89例中急性B淋巴系白血病（B-ALL）54例，男32例，女22例，中位年龄5岁；急性T淋巴系白血病（T-ALL）10例，男9例，女1例，中位年龄6岁；急性髓性白血病(AML)25例，男17例，女8例，中位年龄7岁。所有患者都经FAB分型法以及流式细胞术免疫分型法确诊，并用PVDL（泊尼松、长春新碱、柔红霉素、左旋门冬酰胺酶）方案进行诱导缓解治疗。在第1疗程结束而达到临床缓解后，对部分B-ALL病例进行MRD监测。正常对照7例，均为上海儿童医学中心儿保科体检正常的儿童，中位年龄6.6岁。
主要仪器与试剂
流式细胞仪（FACS Calibure Becton Dickinson产品）；Anti-pRb-FITC (Becton Dickinson PharMingen产品)； 鼠IgG1-FITC(Becton Dickinson PharMingen产品)作为同型对照；CD45-PC5；8E透膜剂(美国St.Jude Children's Research Hospital, Dr Dario Campana 赠送)；胎牛血清（Gibco产品）；牛血清白蛋白（Sigma产品）； Ficoll淋巴细胞分离液。
标本收集及处理
取白血病患者和正常儿童0.5 ml骨髓液，用Ficoll 分离液分离单个核细胞，用PBSA (含0.2 % 牛血清白蛋白及0.2 % 叠氮钠的PBS)洗2遍后悬浮。调节每管细胞数为（2-3） ×106, 先用表面抗原标志CD45-PC5标记，孵育10分钟。用PBSA洗2 遍，加入8E透膜剂避光40分钟。离心5分钟去上清，加入Wash 缓冲液(含5 % 胎牛血清，1.5 % 牛血清白蛋白，0.0055% EDTA 和0.2% 叠氮钠的PBS) 10分钟。离心去上清，用Wash 缓冲液再洗1遍。加入Anti-pRb-FITC和鼠IgG1-FITC抗体进行胞浆染色10分钟，用Wash 缓冲液洗2 遍，多聚甲醛悬浮待用。作细胞周期分析时，作PI DNA染色处理，先将细胞用30%乙醇固定，37℃孵育20分钟，PI染液染色，室温封闭至上机分析。
流式细胞术检测分析
用FACS Calibur流式细胞仪检测，测定前先用标准荧光微球校准仪器。用CellQuest软件(version 3. 2)获取分析10 000个细胞。不同的抗体组合及不同的患者标本都用同一设定条件检测。应用CD45/SSC设门法将不同型的白血病细胞与正常细胞分离开来。pRb表达水平以除去阴性对照的百分比例表示。每一标本均进行免疫分型检测，并对B-ALL病例进行MRD筛选。
MRD监测
患者诱导治疗结束后的骨髓标本，经Ficoll分离液分离单个核细胞后, 用筛选时确认为有效的抗体组合进行4色荧光标记检测。应用Shen等建立的B-ALL MRD监测方法检测［3］。
早期预后反应判定
根据上海儿童医学中心ALL-XH-99及NHL-99方案按序化疗： ①ALL患儿以治疗第7天强的松试验作为肿瘤细胞对激素治疗的敏感性评估指标。强的松治疗第7天外周血白血病细胞下降至≤1 000/μl为强的松反应良好（pGR）组，≥1 000/μl 为强的松反应不良（pPR）组； ②ALL患儿以第19天骨髓像及MRD检测作为肿瘤细胞对早期联合化疗的敏感性评估指标。第19天骨髓中镜下原始淋巴细胞小于5%，MRD阴性定为早期联合化疗反应良好组，大于5%，MRD阳性则为早期联合化疗反应不良组； ③以治疗第35±10天达缓解及部分缓解作为早期联合化疗反应良好组，反之为早期联合化疗反应不良组。以上标准只要符合其中一项，或不符合但治疗过程中死亡、发生急性粒细胞白血病变等情况即被列为预后不好，反之为预后良好。
统计学处理
应用SPSS 11.5和Sigma Plot 9.0统计软件，对pRb值作相关分析。对各组数据首先进行正态性检验，正态分布数据以±SD表示，非正态分布数据以中位数M及其5%-95%分布范围表示，组间数据分析采用秩和检验。率的比较采用χ2检验。相关性采用线性相关分析。P值<0.05作为统计学有显著性意义标准。
结果
pRb在儿童急性白血病中的表达
流式细胞术检测白血病细胞中pRb的表达由于白血病患儿骨髓标本中的白血病细胞CD45表达较正常细胞偏低，应用CD45/SSC设门法可以将患者骨髓中白血病细胞与正常细胞分离开来。在直方图中以除去阴性对照的Anti-pRb-FITC荧光表达区域设门M1，计算pRb的表达百分数，以此来评估患儿肿瘤细胞的pRb表达水平。对每一例标本同时设门检测白血病细胞与非白血病细胞的pRb表达情况，结果见图1。
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