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pRb在儿童急性白血病中的表达
儿童急性白血病患儿骨髓肿瘤细胞的视网膜母细胞瘤蛋白的表达值呈非正态分布，其具体表达量见附表。各类白血病中肿瘤细胞pRb的表达量明显高于正常水平，与正常对照相比均存在显著性差异（AML P=0.019, T-ALL P=0.002, B-ALL P=0001）。并且在同一类急性白血病中白血病细胞pRb 的表达量显著高于非白血病细胞，差异均有统计学意义（P<0.05）。急性白血病组间pRb的表达量也不尽相同，差异有显著性意义（P=0.015）。组间两两比较，B-ALL中pRb的表达量高于AML，但差异无显著性意义（P>0.05）, T-ALL中pRb的表达量高于B-ALL，也高于AML且差异均有显著性意义（P<0.05）。将B-ALL和T-ALL同归类为一类急性淋巴系白血病，比较ALL与AML中间表达量的差异，ALL 22.33 (0.63-74.30) 显著高于AML 12.51(0.25-64.43)（P=0.018）。同时，我们检测到在部分白血病细胞中pRb有缺失表达，缺失表达率分别为： AML 7/25(28%), T-ALL 1/10(10%), B-ALL 6/54(11%), AML的缺失率明显高于其他型白血病。缺失率的比较用卡方检验，组间比较及两两比较均未发现差异的显著性（P=0.136）(P>0.05)。
pRb的表达水平与白血病细胞周期有关
视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）是细胞周期的抑制子，为验证pRb的表达是否能够将肿瘤细胞限制在G1期，我们应用流式细胞仪的PI DNA染色法进行了6例不同类型白血病细胞的细胞周期分析。结果发现在所有检测的6例标本中非白血病细胞的细胞周期分析是一致的，但在肿瘤细胞中pRb表达阳性的T-ALL和AML中处于G1期的白血病细胞数高于pRb表达阴性的病例，但差异不明显，而pRb表达阳性的B-ALL处于G1期的白血病细胞数却显著高于pRb表达阴性的病例（92% vs 77%）（图2）。这种差异性可能具有重要基础研究与临床应用意义，值得我们今后分析更多病例，更深入的探讨。Table . Expression of pRb in child acute leukemia（略）
pRb与微小残留病监测的相关性
对初发患儿标本做pRb表达检测的同时，根据我们以前建立的急性B系淋巴细胞白血病MRD监测的方法，我们对其中的37例标本作了19天及早期缓解后的MRD检测，比较初发病人的pRb表达水平与MRD的关系发现，在B-ALL中MRD阴性组为21例，pRb表达中间值为 22.90 (0.75-92.91)；MRD阳性组为16例，pRb为 9.50 (0.40-44.00) 。MRD阳性组中pRb的表达量明显低于阴性组，且差值有统计学意义（P=0.047）。为验证白血病的治疗过程中pRb表达水平的检测是否具有重复性，我们又对大部分作19天MRD检测的骨髓标本检测其治疗后的pRb表达水平，检测发现在同一患者标本中初发和MRD检测时非白血病细胞中pRb表达水平是稳定（图3）。如图示该病例患儿初发时骨髓中非白血病细胞的pRb表达量为8.03%，做19天MRD检测时骨髓中非白血病细胞的pRb表达量为8.04%。
pRb与危险度的相关性分析
我们研究pRb与危险度的关系拟分析pRb的表达量是否与白血病的危险度有关联，从而决定是否对于治疗起作用。对46例检测过pRb表达且接受治疗的患儿进行的危险度评价表明：低危组（LR）, 中危组（MR），高危组（HR） pRb的表达量中间值依次为16.46 (0.61-63.52 )， 22.90 (2.04-74.35)， 29.87 (0.44-92.82)。虽然低危组低于中危组、高危组，但统计学三者比较 (P=0.372) 或组间两两比较 (P低中=0.188; P低高=0.770; P中高=0.354) 均未发现差异的显著性。
pRb与早期治疗预后的相关性研究
在检测pRb表达的41例病人中，我们对其进行了治疗效果的综合评价，判定标准如前。其中预后良好组为24例，pRb 29.75（2.06-72.33）；预后不好组17例，pRb 18.62 (0.40-41.04)。 预后不好组pRb的表达量低于预后良好组，两者比较有显著性差异（P=0.037）。对其进行相关性分析发现，pRb的表达量与治疗预后之间存在一定相关性（r =-0.335, P=0.032）。
讨论
视网膜母细胞瘤基因 (Rb) 是第一个被克隆成功的肿瘤抑制基因, 其编码的视网膜母细胞瘤蛋白（pRb），既可通过与E2F、Elf-1等转录因子结合成复合物阻止转录因子活化从而控制着细胞的生长和分化, 又可通过调控与细胞增殖有关的原癌基因的功能如c-myc、c-fos等抑制细胞增殖促进细胞分化。Rb基因的异常造成pRb缺失表达或表达异常，细胞失去自身生长负调节能力，导致肿瘤的发生［4］。自Rb作为抑癌基因克隆成功后，关于其在血液系统肿瘤的异常表达研究表明，Rb的异常表达与白血病的发展及预后有关。Sauerbrey等［5］研究发现在急性白血病中Rb失活的频率占30%-64%, Rb基因结构异常达18%。在急性髓性白血病中, Rb蛋白缺失占19%-55%。Rb基因的缺失在肿瘤中是一普遍现象，Rb基因缺失的结果是导致pRb蛋白水平的低表达或不表达。在各类急性白血病中我们均检测到有pRb蛋白水平的缺失表达，缺失表达率分别为： AML 28%（7/25）, T-ALL 10%（1/10）, B-ALL 11%（6/54）。AML的缺失率高于其他型白血病，这与国外报道结果基本一致［2］。AML与B-ALL，T-ALL缺失率的差异无显著性，说明pRb在各类白血病中的缺失表达具有普遍性。在我们研究的89例新发各类急性白血病中，pRb的平均表达量明显高于正常水平，ALL的表达水平高于AML且有显著性差异。同时发现在多例病人中pRb的表达中间值18.37（0.55-70.37）大大高于正常水平。因为以前的研究表明，pRb的表达与其磷酸化状态以及处于肿瘤特异性的S期肿瘤细胞比例呈正相关［6］，所以我们发现的各类白血病中高水平表达的pRb可能以磷酸化形式存在。虽然高度表达，但pRb失去活性，释放与之结合的转录因子E2F或暴露其结合位点，促进细胞周期越过G1/S限制点，所以pRb这种形式的高水平表达也可提示肿瘤细胞增殖活跃。在白血病的发生中，可能存在细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖激酶等pRb上游调控因子的异常表达，使pRb高异常表达，高磷酸化。近年来研究发现，pRb影响肿瘤细胞的增殖不仅仅是通过作为细胞周期的调控子发挥重要作用，还可能通过其他作用机制如抑制细胞凋亡等发挥作用［7］。所以白血病肿瘤细胞中pRb不仅缺失表达可参与肿瘤的发生，pRb的高水平表达可能通过不同的机制如高磷酸化状态，抑制细胞凋亡等导致肿瘤的发生。可见pRb的缺失表达及高水平异常表达均可能参与急性白血病的发生发展。从我们6例pRb不同表达水平的各种急性白血病细胞周期分析中得出，pRb不同表达水平的T-ALL、AML中处于G1期的白血病细胞数差异不大，而B-ALL中pRb表达阳性病例G1期的白血病细胞数却高于pRb表达阴性的病例，这表明pRb在不同类型白血病的发生发展过程中可能发挥着不同的作用，这还有待于我们进一步探讨。我们利用此方法检测得出，在B-ALL疾病诊断时的不同的危险度组中pRb的表达无显著性差异，不能作为判别危险度的一项指标。目前MRD对于急性白血病特别是B-ALL的治疗监测起着重要作用，分析MRD阳性组和阴性组pRb的表达发现MRD阳性组中pRb的表达量显著低于阴性组。并且我们检测的几例缓解后作MRD时的骨髓细胞发现，初发时pRb高表达而治疗后表达明显降低或不再表达，而非白血病细胞pRb的表达量是稳定的。这一现象的具体应用还需进一步临床标本的实验验证，但至少这可提示pRb的表达可以作为一项MRD的检测指标应用于临床的可能性。对一些临床上常用的化疗药物作用机制研究发现，其发挥作用的实质是通过调控pRb网络各组分，使无限增殖的肿瘤细胞细胞周期停止进行或诱导其凋亡［8］。所以pRb的异常表达可影响化疗药物的作用。以往学者报道，pRb的表达与非霍奇金淋巴瘤、急性粒系白血病等血液系统恶性肿瘤的预后的关系结果不一，并缺少系统的研究pRb表达量与急性B系淋巴细胞白血病预后关系的资料。我们的结果表明，在B-ALL早期治疗反应预后不好组pRb的表达量低于预后良好组，两者比较有显著性差异。在检测的4例pRb阴性表达的B-ALL患者中有3例预后差（占75%），而正常的预后差的比例占41.5%，说明pRb低表达的患者预后相对较差，所以初诊时检测pRb的表达水平对于判断疗效和预后有一定的意义。综上所述，应用流式细胞术检测儿童急性白血病中pRb的表达研究结果表明，pRb在白血细胞中存在缺失或高度表达等异常形式的表达，可能通过不同的机制在白血病的发病机制中发挥作用，在不同类型的急性白血病细胞中pRb的表达也存在一定差异。而且pRb的表达与MRD检测、早期治疗反应的预后存在相关性，这对于B-ALL的治疗监测及预后评估具有指导意义。
【参考文献】
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7 Nakayama K, Yamada Y, Koji T, et al. Expression and phosphorylation status of retinoblastoma protein in adult T-cell leukemia/lymphoma. Leuk Res, 2000; 24: 299-305
8 Dimberg A, Oberg F. Retinoic acid-induced cell cycle arrest of human myeloid cell lines. Leuk Lymphoma, 2003; 44: 1641-1650. 上一页 [1] [2] |
