作者：郭长梅，惠延年，王雨生，田艳明，王静波，马吉献
【摘要】 目的 观察重组人结缔组织生长因子(rhCTGF)对视网膜色素上皮(RPE)细胞增生和黏附的影响。方法 用CTGF蛋白、多聚赖氨酸(PLL)和胶原分别包被培养板，观察CTGF促进RPE细胞黏附的作用；用四唑盐(MTT)比色试验和流式细胞仪(FCM)测定RPE细胞增生反应。结果 10-30mg/L的CTGF蛋白提高RPE细胞的贴壁黏附能力，与未包被的对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；30mg/L CTGF促进RPE细胞黏附的能力与0.1g/L胶原的作用一致，但略低于0.1g/L PLL的作用。MTT实验显示CTGF刺激RPE细胞生长，CTGF作用24h刺激RPE细胞增生的能力最强。FCM测定细胞周期结果显示S期百分比随着CTGF浓度增加而逐渐增加，无血清培养的对照组S期百分比为(7.5±0.4)%，60μg/LCTGF刺激24h后，S期百分比上升至(16.1±2.0)%。结论 CTGF可以促进RPE细胞的黏附和增生，在增生性玻璃体视网膜病变等眼内增生性疾病中可能有重要意义。
【关键词】 结缔组织生长因子；视网膜色素上皮细胞；细胞黏附；细胞增生
增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)是孔源性视网膜脱离及其视网膜复位手术后的严重并发症，视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE)细胞是其主要的增生细胞[1]。RPE细胞在炎性因子等刺激下游离移行，离开原位后附着在玻璃体纤维、视网膜表面和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)上，才能获得异常增生分化的能力。RPE细胞的黏附和异常增生，是PVR病理过程的重要环节,也是目前研究的一个热点。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是近几年发现的一个新的分泌型生长因子，分子质量为38ku、富含半胱氨酸的分泌蛋白，属于近年发现的一个新的即刻早期基因家族——CCN 家族的成员，具有多种生物学功能，包括参与调节多种细胞的生长及ECM的产生，在细胞分化和组织创伤愈合等生物学过程有重要意义[23]。在本研究中，我们的目的是观察重组人CTGF(rhCTGF)对RPE细胞增生和黏附功能的影响，为防治PVR提供一个新思路。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
rhCTGF(32mg/L)由中国医学科学院医学生物学研究所病毒免疫室李琦涵教授惠赠；多聚赖氨酸(polyLlysine, PLL)、胶原、小牛血清白蛋白(BSA)、四唑盐(MTT)购自美国Sigma公司；DNAPrep Reagent System 试剂盒购自美国Coulter公司。
1.2 人RPE细胞培养与鉴定
从意外死亡的健康成年男性获取供体眼球，于死亡后24h内分离培养RPE细胞，具体方法参考王雨生等报道的方法[4]。传代细胞用含10%(体积分数)小牛血清的Dulbecco改良Eagle 培养基和Hams F12(DMEM/F12)的混合完全培养基(青霉素100u/mL，链霉素100u/mL)，置于37℃、5%(体积分数)CO2孵箱中培养；用抗人角蛋白抗体免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。取第4-7代细胞用于实验。
1.3 RPE细胞黏附试验
1.3.1 包被培养板
将纯化的rhCTGF用0.01mol/L PBS配成 5、10、20、30mg/L 4种不同质量浓度。将4种不同质量浓度rhCTGF、PLL(0.1g/L)、胶原(0.1g/L)分别加入96孔板中，每孔50μL，4℃下孵育16h；10g/L BSA 室温下孵育1h，封闭未饱和的蛋白结合位点，无菌PBS冲洗每孔2遍，在超净台中吹干。未包被的培养板作为对照。
1.3.2 黏附试验
消化收集近铺满期的RPE细胞，用无血清培养液洗涤细胞2次(1000r/min，离心5min)，以2.5×105/mL细胞密度重悬于含10g/L BSA的无血清DMEM/F12培养基中，每孔50μL细胞悬液接种于包被好的96孔板中，置于37℃培养箱中让细胞贴壁。60min后将培养板取出，无菌PBS洗涤每孔2遍以洗去未贴壁细胞。每孔加入含MTT溶液(5g/L，20μL)的新鲜培养液150μL。继续培养4h，弃培养液，每孔加入150μL DMSO，充分振荡10min，在酶联免疫检测仪上在490nm波长测定各孔吸光度值(absorbance，A值)。每个浓度设8个重复孔，试验重复3次。
1.4 CTGF对RPE细胞促增生作用
1.4.1 实验分组
①无血清对照组；② 无血清培养液+rhCTGF组：设4种质量浓度，分别为5、15、30和60μg/L。
1.4.2 MTT比色试验
2.5g/L胰蛋白酶消化单层培养的RPE细胞，用含10%(体积分数)血清的DMEM/F12培养液制成单个细胞悬液，调整RPE细胞密度为1×104/mL，接种于96孔培养板中，每孔100μL。置于37℃ CO2孵箱中培养24h，换用无血清的DMEM/F12培养液使细胞静止24h。按实验分组，再分别加入含不同浓度rhCTGF的新鲜无血清培养液。继续培养12、24、36和48h。在不同培养时间点，每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL，37℃继续孵育4h，中止培养，弃孔内上清液。每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上在490nm波长测定各孔A值，计算细胞生长促进率。设不接种细胞的空白调零孔。每组实验设8个重复孔，实验重复3次。生长促进率＝[(实验组A值-对照组A值)÷对照组A值]×100%
1.5 流式细胞术(FCM)测定细胞增生周期
近铺满期RPE细胞消化后，以1×104/mL的细胞密度等量接种于5个25cm2的细胞培养瓶中，置于37℃ CO2孵箱中培养24h，换用无血清的DMEM/F12培养液使细胞静止24h。按实验分组，再分别加入含不同质量浓度rhCTGF的新鲜无血清培养液，继续培养24h，2.5g/L胰酶消化收集细胞，PBS洗涤细胞2次，加入1mL PBS将细胞混匀，再加入2mL无水乙醇立即振荡混匀，用封口膜封口，置于4℃冰箱固定24h后送检。检测前用PBS洗涤细胞2次，调整细胞密度为1×106/mL，取100μL样品，加入DNAPrep stain染料500μL在室温中避光染色15min，上机检测。FCM检测时所用激光波长为488nm，发射波长为525nm，激光功率为260mW。每份样本均检测5500个细胞，用DNA MultiCycle 软件进行统计拟合分析。实验重复3次。
1.6 统计学处理
试验数据均用±s表示，采用SPSS 10.0 统计软件行t检验分析两组间差异，显著性水准设为0.05。
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