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2 结 果
2.1 人RPE细胞培养与鉴定
第3代人RPE细胞经免疫细胞化学法行抗人细胞角蛋白(CK)染色，可见细胞浆呈棕黄色着色，表现为CK免疫反应阳性，阳性率为100%。
2.2 CTGF对RPE细胞黏附的影响
为了排除其他血清蛋白以及细胞增生对试验结果的影响，我们采用含10g/L BSA的无血清培养液，RPE细胞在无血清培养液中的贴壁能力较弱。10-30mg/L的CTGF蛋白和PLL(0.1g/L)、胶原(0.1g/L)包被培养板，均可以提高RPE细胞的贴壁黏附能力，与未包被的对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。并且CTGF介导RPE细胞黏附呈剂量依赖性。30mg/L CTGF促进RPE细胞黏附的能力与0.1g/L胶原的作用一致，但略低于0.1g/L 的PLL(图1)。
2.3 CTGF对RPE细胞增生的影响
2.3.1 MTT比色实验
无血清DMEM/F12静止的RPE细胞，加入不同浓度rhCTGF作用12、24、36和48h后，MTT法测定反映细胞数的A值，结果见表1。15-60μg/L CTGF均可以刺激RPE细胞生长,呈剂量依赖性，与对照组相比差异有统计学意义 (P<0.05)。5μg/L CTGF在24h的A值与对照组间差异有统计学意义(P<0.05)，其余各时间点的差异无统计学意义。从图2可见，CTGF作用24h刺激RPE细胞增生的能力最强。表1 MTT法检测rhCTGF对RPE细胞增生的影响（略）
2.3.2 FCM测定细胞周期
rhCTGF处理无血清培养的RPE细胞24h后，FCM检测细胞周期各期的数值见表2，DNA波形图见图3。经统计学检验，RPE细胞的S期百分比随着CTGF浓度增加而逐渐增加，15-60μg/L CTGF组与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。表2 rhCTGF处理RPE细胞后细胞周期的变化（略）
3 讨 论
CTGF对多种细胞的生长具有调节作用，在体外能诱导多种细胞增生，如CTGF可刺激正常大鼠肾成纤维细胞 (NRK)增生，刺激DNA合成[5]。Shimo 等[6]研究发现用CTGF反义寡核苷酸或反义RNA阻断内源性CTGF的表达，也可以抑制血管内皮细胞的增生。CTGF通过调控周期蛋白依赖性激酶p27Kipl引起pRb超磷酸化，释放E2F，调控cyclin A基因的转录，升高cyclin A水平，使细胞从G1晚期进入S期，从而调节TGFβ的促有丝分裂活性；在成纤维细胞中还可持续活化p42/p44 MAPKs，促进细胞增殖[5]。CTGF具有ECM相关的信号蛋白属性，既是肝素结合型ECM相关蛋白，又与Von Willegrand因子、血小板反应蛋白等其他ECM相关信号蛋白有类似序列，可以和细胞膜上的超家族受体整合素结合[2,7]。整合素在正常情况下是无活性的，一旦在激素、细胞因子、ECM或其他细胞的刺激下，其构型和亲和力发生改变，可以与局部黏附的激酶结合产生作用，激活MAPK p42/44 和Rac，引起细胞内一系列生化改变。CTGF即通过此信号传导机制来调节细胞的生物学功能，如Fisp12(鼠源性CTGF)通过αvβ3整合素依赖途径促进血管内皮细胞的黏附、存活[8]。近来还发现CTGF经整合素α6β1和细胞表面乙酰肝素硫酸酯蛋白聚糖(HSPGs)介导与成纤维细胞的黏附[9]。CTGF在较高质量浓度(mg/L)时同样促进上皮细胞的黏附[10]，与我们的实验结果一致。孔源性视网膜脱离发生时，刺激RPE细胞重新进入细胞周期和活力增加的原因目前尚不清楚，但似乎与RPE细胞间的接触丧失以及对某些生长因子的敏感性增强有关[11]。RPE细胞开始移行、黏附、异常增生并分泌胶原等ECM，以此来修复缺损区。Hinton等[11]用免疫组化方法证实PVR增生膜的实质细胞和细胞外基质中存在CTGF高表达。Meyer等[12]从基因水平证实增生性视网膜疾病的纤维血管膜中转化的RPE细胞和成纤维细胞样细胞表达CTGFmRNA，并且与Ⅰ型胶原和细胞黏合素的表达有一致性。我们以前的研究也显示PVR增生膜上高表达CTGFmRNA[13]。本实验采用MTT法和FCM发现CTGF可以剂量依赖性地刺激无血清培养的RPE细胞增生；10-30mg/L的CTGF蛋白可以提高RPE细胞的贴壁能力，介导RPE细胞黏附呈剂量依赖性，30mg/L CTGF促进RPE细胞黏附的能力与0.1g/L胶原的作用一致，但略低于0.1g/L PLL的作用。以上研究结果提示CTGF可以促进RPE细胞的黏附和增生，在PVR等眼内增生性疾病中可能有重要意义。致谢：本研究得到德国洪堡基金会(Alexander von Humboldt Foundation)仪器设备捐赠基金(V8151/02085)资助。
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