作者：周润海　严宏　段小莉　王百忍

　　cnIntravitreal glutamate injection induces an increased phosphorylation of ERK1/2 in retinal Müller cells of rats

　　【Abstract】  AIM:  To analyze the changes of phosphoERK1/2 in retinal Müller cells by using an intravitreal glutamate insult and to explore the neuroprotection role of activated (phosphorylated) ERK1/2 against glutamate cytotoxicity in retina. METHODS:  A 2 μL of saline or glutamate (375 nmol) was injected into the random unilateral vitreous body for 3 d or 7 d in 18 SD rats. The rats were randomly divided into 3 groups: Control group (saline injections), glutamate injections 3 d  group and glutamate injections 7 d group. The changes of the activated ERK1/2 were studied by immunohistochemical staining and computerpicture analytic system. RESULTS:  After 7 d intravitreal glutamate insult, the activated phenotypes of retinal cells exhibited a hypertropic morphology and increased immunostaining for ERK1/2. By the staining pattern in shape and localization, the positive cells were presumed to be Müller cells. The gray level of glutamate injections 7 d group was the lowest among the 3 groups. The difference between glutamate injections 7 d group and other two groups was significant (P<005). CONCLUSION:  Increased phosphorylated ERK1/2 in retinal Müller cells by using an intravitreal glutamate insult suggests that phosphoERK1/2 plays an important neuroprotective role when retinal ganglion cells are injured by glutamate cytotoxity.

　　【Keywords】  glutamic acid;  retinal Müller cells; ERK1/2

　　【摘要】 目的： 观察大鼠玻璃体内注射谷氨酸后视网膜Müller细胞内ERK1/2分子的磷酸化水平，为探讨ERK1/2通路的激活在谷氨酸毒性损伤视网膜时的保护作用提供形态学证据.方法： SD大鼠18只，随机分为生理盐水对照组、谷氨酸注射后3 d组和7 d组，每组6只.随机选取大鼠的一只眼进行玻璃体内注射，实验组注射谷氨酸(375 nmol) 2μL， 对照组注射等量生理盐水，注射后3或7 d后，取出眼球作冰冻切片，采用免疫组化法显示视网膜中的含磷酸化ERK1/2的阳性结构，用图像分析比较对照组和不同实验组的平均灰度值.结果： 注射谷氨酸7 d组的视网膜Müller细胞内ERK1/2表达上调，其灰度值（9700±221）比对照组灰度值（12800±323）和注射谷氨酸3 d组的灰度值（12600±412）均低（P<005），与这两组的灰度值之间差异有显著性.结论： 玻璃体内注射谷氨酸导致大鼠视网膜Müller细胞激活，ERK1/2磷酸化水平增高，ERK1/2通路的激活可能在视网膜节细胞受到兴奋性毒性损伤时起到重要的保护作用.

　　【关键词】  谷氨酸；视网膜Müller细胞；ERK1/2

　　0引言

　　目前许多研究表明青光眼患者视神经节细胞（RGCs）凋亡是由于高眼压所致的机械性损害和谷氨酸增多的化学性毒性作用.谷氨酸是视网膜的组成成分之一，是感光细胞、双极细胞和神经节细胞的主要神经递质.但谷氨酸浓度过高时，会使其受体超兴奋，对神经细胞有明显的毒性作用，引起神经元的损伤和凋亡［1］.ERK1/2(extracellular signalregulated kinases,ERK1/2)，是MAPK家族的重要成员之一，对丝裂素、激素、兴奋性毒素等生理刺激和病理刺激均可作出不同的反应，控制着细胞的适应、增殖、分化、存活和凋亡的生理过程［2］.Siger等证明，雌激素可通过MAPK信号转导途径激活培养的大鼠皮质神经元的ERK1/2通路，对抗谷氨酸诱导的大脑皮质神经元的凋亡，但目前尚缺乏在体的证据.本研究于在体动物，观察了玻璃体内注射谷氨酸后视网膜Müller细胞内ERK1/2分子的磷酸化水平，为探讨ERK1/2通路的激活在谷氨酸毒性损伤视网膜时的保护作用提供形态学证据.

　　1材料和方法

　　11实验动物和分组选择18只SD大鼠（第四军医大学实验动物中心提供），体质量200～250 g，无眼疾，雌雄不拘.饲养环境： 光照时间6 AM~6 PM，光照强度330 lux，室温21℃.随机分为生理盐水对照组、谷氨酸注射后3 d组和7 d组，每组6只.

　　12谷氨酸注射模型的建立用10 ｇ/Ｌ戊巴比妥钠按 50 mｇ/kg行ip麻醉 ,用 5 ｇ/Ｌ丁卡因点眼2次行眼表麻醉，用10 μL的微量注射器（上海医用激光仪器厂）经颞侧巩膜刺入玻璃体内，处理组玻璃体内注射375 nmol的谷氨酸（美国Sigma公司，粉剂用生理盐水溶解）2 μL［3］，对照组眼内注射生理盐水2 μL.

　　13标本固定和切片每组模型建好后，动物成活3或7 d，然后用10 g/L戊巴比妥钠（80 mg/kg）行ip麻醉，麻醉后开胸,经心脏用100 mL生理盐水和40 g/L 多聚甲醛(pH 74)固定液500 mL灌注,取出眼球,用200 g/L蔗糖溶液后固定.将眼球用TissuTek包埋,在－20℃的冰冻切片机内做眼球矢状冰冻切片，片厚16 μm.切片在－20℃保藏.

　　14免疫组织化学染色采用免疫组化ABC染色法.10 mmol/L PBS漂洗5 min×3次；30 g/L H2O2封闭30 min； 10 g/L牛血清白蛋白和30 mL/L正常羊血清在室温分别孵育切片20 min；切片浸入3 mL/L Triton×100大约5 min；兔抗pERK1/2抗体（1∶1000,Sigma公司）室温下孵育切片24 h；生物素化的羊抗兔IgG（1∶500,Vector公司）室温下孵育4 h；生物素辣根过氧化物酶复合物（ABC,1∶500 Vector公司）室温孵育2 h；硫酸镍铵加强DAB蓝色反应呈色，当阳性产物呈深蓝色而背底几乎无色时终止反应,贴片,脱水、透明、封片，光镜下观察并照相.

　　15图像分析采用Quantimement 570图像分析仪，放大倍数为40×，用Quic图像分析软件测得视网膜免疫反应强度（平均灰度，染色越深灰度值越小，最黑为0），每个切片随机选择3个视野，测定阳性细胞的灰度值，以平均值作为判断该大鼠视网膜上的pERK表达水平的标准.
统计学处理3组均数比较用方差分析，均数间多重比较用LSDt检验.设显著性水准α=005.统计分析采用SPSS110 软件完成.

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