碱性成纤维细胞生长因子对不同年龄白内障患者晶状体上皮细胞增殖的影响

　　中华眼科杂志2000年第36卷第5期

　　申屠形超　姚克　孙朝晖　余海　杨亚波

　　摘　要　目的　观察碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）对不同年龄白内障患者晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells, HLEC）增殖的影响并探讨机制。方法　将白内障手术中取出的晶状体前囊膜在10μg/L bFGF中培养48 h，免疫组织化学法染色后，采用医用多功能图像分析软件测定增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）阳性面积率；免疫组织化学方法测定晶状体前囊膜bFGF受体蛋白表达数量。结果　bFGF可促进不同年龄白内障患者HLEC增殖，其促增殖作用以及HLEC内bFGF受体蛋白的表达均与白内障患者年龄呈负相关（P＜0.01）。结论　bFGF参与后发性白内障的形成；随着白内障患者年龄递减，bFGF促HLEC增殖作用增强，提示其与儿童后发性白内障发生率高有关。

　　关键词：成纤维细胞生长因子，碱性；上皮细胞；晶体；年龄

　　白内障是目前致盲的首要原因，囊外摘除或超声乳化吸除联合人工晶状体植入是目前乃至将来相当长时间内治疗白内障的首选方法。但目前该手术方法尚存在较多问题，例如手术创伤，残留晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells, HLEC）反弹性增殖、移行、化生，分泌胶原形成后发性白内障等，均影响患者术后视力的恢复，尤其婴幼儿患者，其后发性白内障的发生率高达100%。近年来，文献报道了多种强效调节HLEC功能的多肽生长因子，其中以碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）最引人注目。我们在以往的研究中发现，多种人眼组织中均存在bFGF，并证实1～100μg/L bFGF可促进HLEC增殖［1］。但目前国内、外仍缺乏bFGF对不同年龄HLEC促增殖作用的比较研究。本研究针对此问题进行了初步探讨。

　　 材料和方法

　　一、材料

　　DMEM（美国Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青生物制品公司）；bFGF（美国Gibco公司）；链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化试剂盒（福建迈新技术开发公司）；即用型鼠抗人增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体（福建迈新技术开发公司）；鼠抗人bFGF受体抗体原液（美国Santa cruz公司）。

　　二、方法

　　1．bFGF对不同年龄白内障患者HLEC的促增殖作用：收集在我院行手术治疗的老年性、并发性（合并高度近视）及先天性白内障患者23例，按年龄分为3组：老年组≥50岁，8例；青年组25～49岁，8例；少年组0～24岁，7例。将术中撕囊后取下的直径5或6mm的晶状体前囊膜一分为二，分别用于实验及自身对照研究，培养于24孔板中。实验组：加入含有10μg/L bFGF的2%小牛血清DMEM 1 ml；对照组：加入2%小牛血清DMEM培养液1 ml。于37℃、5% CO2条件下孵育48 h［2］。取出培养的晶状体前囊膜，室温下甲醇固定1 h。应用链酶卵白素-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase technique,S-P)免疫组织化学法测定PCNA蛋白，3，3′-二氨基联苯胺（3，3′-diaminbezidine, dAB）显色5～10 min，苏木素复染，中性树胶封片。置于光学显微镜下观察，阳性细胞表现为棕黄色细胞核，阴性细胞经苏木素复染后呈蓝色。运用上海交通大学图像分析与模式识别研究所研制的医用多功能图像分析软件，定量分析PCNA阳性面积率，即阳性面积占框面积的百分比。随机测定5个视野，求平均值。

　　2．不同年龄白内障患者HLEC内 bFGF受体蛋白表达数量：收集在我院行手术治疗的老年性、并发性（合并高度近视）、先天性白内障患者19例。按年龄分为3组：老年组≥50岁，7例；青年组25～49岁，6例；少年组0～24岁，6例。将术中撕囊后取下的直径5或6 mm的晶状体前囊膜，置于室温下用甲醇固定1 h。S-P免疫组织化学法测定bFGF受体蛋白表达数量，bFGF受体抗体浓度1∶50，温度为4℃。过夜后，DAB显色5～10 min，苏木素复染，中性树胶封片。置于光学显微镜下观察：细胞内未见黄色颗粒为阴性（-）；细胞内可见淡黄色颗粒为可疑阳性（±）；细胞内可见黄色颗粒为阳性（+）；细胞内可见棕黄色颗粒为强阳性（++）。

　　三、统计学方法

　　数据均采用计算机SPSS统计软件进行分析。

　　 结果

　　1．bFGF对不同年龄白内障患者HLEC的促增殖作用（表1）：在10μg/L bFGF作用下，老年组（t=5.33）、青年组（t=12.29）、少年组（t=15.55）白内障患者HLEC的PCNA阳性面积率均高于自身对照组（图1～4），经配对t检验差异均有显著性（P＜0.01）。其增长倍率，老年组为1.908±0.729，青年组为3.279±2.015，少年组为5.240±3.370，3组比较差异有显著性（F=4.567，P＜0.05）。白内障患者年龄与PCNA阳性面积率增长倍率呈高度负相关性（r=-0.591，P＜0.01）。

　　表1　10μg/L bFGF对不同年龄组白内障患者

　　2. 不同年龄白内障患者HLEC内 bFGF受体蛋白表达：不同年龄组白内障患者HLEC内 bFGF受体蛋白表达数量不同，经多样本秩和检验差异有显著性（H=13.724，P＜0.01）；多重比较结果显示：老年组数量少于青年组，青年组数量少于少年组，差异有显著性（d12=6.631，d23=4.833，P＜0.05）。对白内障患者年龄及bFGF受体蛋白表达数量等级进行相关分析，两者呈高度负相关性(r=-0.895，P＜0.01）。 讨论

　　一、bFGF作用机制

　　强效促细胞增殖因子bFGF，通过与其特异性受体结合，使受体酪氨酸蛋白激酶磷酸化，经三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）结合蛋白/MAPKKK/MAPKK/MAPK信号级联传导系统，引起各种细胞周期调控因子表达改变，如c-Myc,c-Myb,c-Jun,c-Fos,p53和ATF-2等，促使G0、G1期细胞越过限制点进入增殖状态［3］。bFGF可促进来源于中胚层和神经外胚层细胞有丝分裂并诱导其分化，利于组织创伤修复。bFGF在人眼组织中广泛分布，在晶状体及其周围组织（角膜、虹膜、睫状体等）中均可表达。在白内障手术后，由于手术创伤造成晶状体上皮细胞及其周围组织损伤而使细胞内bFGF释放；同时晶状体囊膜损伤可使储存于细胞外间质的bFGF释放［4］,局部高浓度的bFGF［5］将促使残留的HLEC增殖、移行及纤维化生，为后发性白内障的形成提供条件。

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