蚕蚀性角膜溃疡患者外周血淋巴细胞免疫表型和T细胞活化的研究
中国病理生理杂志 1999年第10期第15卷 短篇论著
作者：谢汉平 陈家祺 杨培增 曾耀英 葛琪 狄静芳 冯铮 孙荭
单位：陈家祺 杨培增：中山医科大学中山眼科中心(广州 510060)；谢汉平：重庆第三军医大学附属第一医院眼科(重庆 400038)；曾耀英 葛琪 狄静芳 冯铮 孙荭：暨南大学组织移植免疫中心
关键词：角膜溃疡；免疫表型分型；淋巴细胞转化；流式细胞术
摘要 目的：观察蚕蚀性角膜溃疡患者外周血淋巴细胞免疫表型和T细胞活化的变化，进一步探讨本病患者的免疫功能。方法：用流式细胞术检测8例活动性蚕蚀性角膜溃疡患者外周血淋巴细胞30项免疫表型变化，用植物凝集素和沸波醇酯作为刺激剂，以HLA-DR，CD69、CD71、CD25的表达为T细胞活化的指标，用流式细胞术分析。结果：蚕蚀性角膜溃疡患者外周血CD4、CD5、CD8、CD10、CD11b、CD15、CD16、CD19、CD23、CD25、CD41、CD57、CD69、HLA-DP、HLA-DR抗原表达阳性淋巴细胞以及HLA-DR、CD69、CD71、CD25在CD3和CD8细胞的表达均明显高于正常对照组。结论：蚕蚀性角膜溃疡患者具有增强的细胞免疫和体液免疫，外周血T细胞及其亚群出现异常活化，反映患者体内存在自身免疫反应而支持该病发病之自身免疫学说。
A study on lymphocyte immune epitopes and T lymphocyte activation
of peripheral blood of Mooren's ulcer patients
XIE Han-Ping,CHEN Jia-Qi,YANG Pei-Zeng,ZENG Yao-Ying,
GE Qi,DI Jing-Fang,FENG Zheng,SUN Hong
Zhongshan Ophthalmic Center,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou(510060)
Abstract AIM:To analyze changes of lymphocyte immune epitopes and T lymphocyte activation of peripheral blood of Mooren's ulcer patients and to study changes of immune function of Mooren's ulcer patints.METHODS：30 immune epitopes expressing on lymphocytes of peripheral blood of 8 patients with active Mooren's ulcer were analyzed by flow cytometry,and using PHA and PDB as stimulators,the expressions of HLA-DR,CD69,CD71,and CD25 on T lymphocytes and its subpopulations of the periheral blood of Mooren's ulcer patients were detected by flow cytometry as the indicators of T lymphocyte activation.RESULTS：The expression rates of CD4,CD5,CD8,CD10,CD11b,CD15,CD16,CD19,CD23,CD25,CD41,CD57,CD69,HLA-DP,and HLA-DR were much higher than that of normal controls.The expression rates of HLA-DR,CD69,CD71,and CD25 on CD3+ and CD8+ of T lymphocytes of the peripheral blood of Mooren's ulcer patients were much higher than that of nomal controls.CONCLUSION：Mooren's ulcer patients have a strong activating capacity for cellular and humoral immune reactions and an aberrant activation of T lymphocyte and its subpopulations,indicating existence of autoimmune response in Mooren's ulcer patients.
MeSH Corneal ulcer; Immunophenotyping; Lymphocyte transformatioin; Flow cytometry
蚕蚀性角膜溃疡是角膜周边部的慢性、疼痛性溃疡，沿角膜周边部延伸，再向中央发展， 是一种复发性，可致盲性角膜病。前人研究表明，该病可能是一种自身免疫性疾病［1～3］，患者存在免疫调节紊乱。然而，本病的细胞和分子免疫机制以及患者免疫调节紊乱的细节尚不清楚。我们用流式细胞仪观察本病患者外周血淋巴细胞免疫表型变化和T细胞活化状态，在免疫调节的分子水平上进一步了解该病的免疫学发病机制。
材料与方法
(一)病例资料：取临床确诊的活动性蚕蚀性角膜溃疡患者8例(10眼)，男、女各4例，年龄24～53岁，均排除了可引起周边角膜溃疡的全身性疾病，并证实近期没有全身性使用过影响免疫功能的药物，另取身体健康者8例作对照，其中男性5例，女性3例，年龄20～35岁。两组年龄经统计学处理无显著性差异。
(二)单克隆抗体和其它试剂：单克隆抗体为荧光异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)或藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记的小鼠抗人单克隆抗体，系以下抗原的抗体：CD2～CD10，CD11a,CD11b,CD15～CD19，CD23，CD25，CD27，CD38，CD41，CD42，CD45，CD45 RA，CD57，CD69，CD71，HLA-ABC，HLA-DP、DR、DQ，IL-IR.p55，羊抗鼠anti lgG PE,anti CD3 FITC,anti CD8 FITC,均购自美国Becton Dikinson Immunocytometry,San Jose。
其它试剂包括植物凝集素(PHA)，沸波醇酯(PDB)，细胞培养液，胎牛血清等。
(三)实验方法：
1.淋巴细胞标记：采用单色或双色直接免疫荧光标记法。肝素抗凝静脉血30 μL与抗体10 μL混合，室温下孵育30 min，用红细胞裂解液(0.155 mol/L NH4Cl,0.01 mol/L KHCO3，0.1 mol/L MEDTA,pH 7.47)裂解红细胞，离心获取有核细胞，用PBS洗涤后，用1%多聚甲醛PBS固定10 min后用流式细胞仪分析。
2.淋巴细胞活化：取患者组和正常组肝素抗凝外周静脉血5 mL，采用全血体外培养法，分3组：
(1) 抗凝血按1∶2用完全RPMI-1640培养液稀释，在5%CO2，37 ℃条件下培养72 h。
(2) 第2组和第3组的抗凝血按1∶2用完全RPMI-1640培养液稀释，分别外加刺激剂PHA 20 μg/mL,PDB 0.1 μmol/mL，在5%CO2， 37℃条件下培养72 h。
3.流式细胞仪数据获取及分析：全部数据用流式细胞仪(FACStarplus,美国BD公司)和软件LYSYS Ⅱ进行双色或单色荧光参数获取及分析。在前散射和侧散射二维Dotplot图中，划出淋巴细胞区，然后对淋巴细胞作FITC 和PE的荧光强度检测，荧光Ⅰ(FL1)为FITC，滤光片为(530±10) nm带通，荧光Ⅱ(FL2)为PE，滤光片为(575±10) nm带通。数据分析时，在确定每次检测阳性细胞百分率之前，根据isotype的非特异性荧光强度设定界线，以确定双阴性、双阳性及单阳性区。
4.统计方法：数据以±s,表示，采用两样本t检验。
[1] [2] 下一页 |
