作者：吕炳健，严宏，王百忍，邝芳，段小莉，张萍

　　Expression of pigment epithelium-derived factor in retina of rats with chronic elevated intraocular pressure

　　LU BingJian1，YAN Hong1，WANG BaiRen2，KUANG Fang2，DUAN XiaoLi2，ZHANG Ping2

　　1Department of Ophthalmology，Tangdu Hospital，Xian 710038，China，2PLA Institute of Neurosciences，Fourth Military Medical University，Xian 710033，China

　　【Abstract】 AIM： To investigate the role of pigment epithelium-derived factor(PEDF)in the injury of optic nerve by chronic elevated intraocular pressure(EIOP) in retina. METHODS: One hundred and two female adult Sprague Dawley rats were randomly divided into three groups: Experimental groups G(G1 h,G12 h,G1 d,G3 d,G7 d,G14 d,G21 d,G28 d),control groups C(C1 h,C12  h,C1 d, C3 d,C7 d,C14 d,C21 d,C28 d)and blank control group D, randomly selected one eye as experimental eye in each rat and 6 rats in each group. The models of EIOP were established by obstructing episcleral veins, using immunohistochemistry stain for PEDF expression in retina and evaluate the rule of the change. RESULTS: Immunohistochemistry analysis of the retinal tissues showed that PEDFpositive cells in group G were promoted after 1 d of the operation(P005),the increase got to the top after 7 d(P005) and lasted to 28 d after the operation(P005). However, there was no significant changes in group C and D in this period(P005).In group C and D,PEDF were positively stained in retinal pigment epithelium (RPE),photoreceptor layer(PRL), out limiting membrane(OLM),out nuclear layer (ONL), inner nuclear layer(INL),inner plexiform layer(IPL),retinal ganglion cell layer(RGCL),retinal nerve fiber layer(RNFL).In group G, it had the same positive stain of PEDF with group C and D, but had a higher positive stain in RGC and RNFL.CONCLUSION: The change of the expression of PEDF in rats retinas was associated with EIOP damage in the spatiotemporal fashion and the increase of PEDF-positive cells in rats retinas was possibly raised by the stress reaction of EIOP damage.
　
　　【Keywords】 pigment epithelium of eye;intraocular pressure；retina；ganglion cell；immunohistochemistry

　　【摘要】 目的： 探讨色素上皮衍生因子(pigment epitheliumderived factor，PEDF)在大鼠视网膜的表达及其与慢性高眼压视神经损伤的关系.方法： 雌性SD大鼠102只，随机分为实验组G(包括G1 h,G12 h,G1 d,G3 d,G7 d,G14 d,G21 d,G28 d),对照组C(包括C1 h,C12 h,C1 d,C3 d,C7 d,C14 d,C21 d,C28 d) 和空白对照组D，各组均为6只，随机选一只眼为实验眼.应用巩膜浅层静脉烧烙法制作慢性高眼压(elevated intraocular pressure, EIOP)模型，用免疫组织化学染色法观察视网膜各层结构PEDF的表达和变化规律.结果： 免疫组化染色显示，G组术后1 d 大鼠视网膜PEDF染色阳性的细胞增多(P005)，并且呈现递增趋势，到7 d 达到高峰(P005)，并持续至28 d 之后(P005)，而C和D组视网膜PEDF阳性细胞数量没有显著变化(P005).C和D组PEDF阳性细胞主要分布在视网膜的色素上皮层(RPE)、视杆视锥细胞层（PRL）、外界膜(OLM)、外颗粒层(ONL)、内颗粒层(INL)、内网状层(IPL)、神经节细胞层(RGCL)、神经纤维层(RNFL).G组PEDF除了在上述的结构有相同的表达以外，在RGCL,RNFL显著增多.结论： 视网膜PEDF阳性细胞表达的变化与EIOP损伤有一定的时效和空间关系，视网膜PEDF阳性细胞表达的增强可能是EIOP损伤的应激反应.

　　【关键词】 色素上皮，眼；眼内压；视网膜；神经节细胞；免疫组织化学

　　0引言

　　色素上皮衍生因子(pigment epitheliumderived factor,PEDF)是新近发现的一种蛋白质,它具有神经保护、抑制新生血管生成等多种生物活性.我们在建立长期稳定EIOP视神经损伤的基础上，用免疫组织化学的方法对慢性高眼压条件下大鼠视网膜PEDF的表达进行研究，探讨PEDF与EIOP视神经损伤的关系.

　　1材料和方法

　　11材料雌性成年SD大鼠购自第四军医大学实验动物中心;羊抗大鼠PEDF抗体（美国Santa Cruz）;兔抗羊IgG抗体（美国Wescor）;ABC复合物、DAB显色试剂盒（美国Sigma）;显微镜（日本Olympus BX60）;相机（瑞士Leica）;Tonopen XL笔式眼压计（美国Jackson公司）.

　　12方法

　　121动物分组及处理取雌性成年SD大鼠(体质量220~250 g) 102只，随机分为实验组G(包括G1 h，G12 h，G1 d，G3 d，G7 d，G14 d，G21 d，G28 d)、对照组C(包括C1 h，C12 h，C1 d，C3 d，C7 d，C14 d，C21 d，C28 d)和空白对照组D，各组均为6只，随机选一只眼为实验眼.G、C组模型制作参照巩膜浅层静脉烧烙法［1］，待眼压达40 kPa以上时视为模型有效，D组不作任何处理.分别于模型建立后1 h，12 h，1 d，3 d，7 d，14 d，21 d，28 d处死大鼠.

　　122眼压测量用Tonopen笔式眼压计检测大鼠眼压，制作模型前7 d于每日10：00测眼压，术后1 h，12 h，1 d，3 d，7 d，14 d，21 d，28 d分别测各组眼压（已处死组除外）.

　　123动物灌注及切片将大鼠用10 g/L戊巴比妥钠按50 mg/kg行腹腔麻醉，开胸，经心脏灌流.先用100 mL生理盐水快速冲洗血液，再注入400 mL固定液（40 g/L多聚甲醛）灌注.待固定液缓慢滴注完毕后，取出眼球.固定30 min，之后将眼球放入200 g/L蔗糖液中浸泡24 h（4℃下），直至组织完全沉底.用恒冷箱切片机（瑞士Leica CRYOCUT 1800）在－23℃条件下，平行于视神经的方向将眼球切成厚度为12 μm的切片，贴于明胶贴片上.室温下干燥30 min后，放入－20℃冰箱保存.

　　124PEDF表达的免疫组织化学染色检测各组取一套眼球切片，室温下晾干2 h，001 mol/L PBS洗涤后，以甲醛双氧水室温下孵育30 min.同前漂洗后，滴加1∶100羊抗大鼠PEDF抗体，室温孵育24 h.漂洗后，滴加1∶300兔抗羊IgG，室温孵育4 h.漂洗后，滴加1∶500 ABC复合物，室温孵育2 h.再漂洗，滴加硫酸镍铵加强的DAB显色.显微镜下监视显色反应, 约10 min后终止反应，依次脱水、透明、封片和镜检.同时以部分切片进行对照实验，即除用牛血清白蛋白稀释液替代一抗外，其他均相同.

　　125视网膜神经节细胞计数在20×10倍显微镜(OLYMPUS BH2)下，随机选取部分视网膜行全视野PEDF染色阳性的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)计数，每组选10个不同视野计数，取平均值.

　　统计学处理： 采用SPSS100统计软件包，所有数据采用方差分析，多组均数间的两两比较采用LSDt检验.

　　2结果

　　21不同时间段眼压变化情况统计学分析表明，术后眼压明显升高(P005)，1 d后眼压趋于稳定，并维持在较高的水平(P005)，并持续到28 d以上(Tab 1).

　　表1各实验组眼压的变化　略

　　22视网膜PEDF表达的免疫组织化学染色检测C和D照组PEDF阳性细胞主要分布在RPE,PRL,OLM,ONL,INL,IPL,RGCL,RNFL(Fig 1).G组PEDF阳性细胞在上述视网膜各层的含量都有所增加，尤其在RGCL和RNFL明显增多(Fig 2).

　　图1－图2　略

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