作者：陈敏 杨水平
【摘要】 目的 探讨地塞米松(Dexamethasone,Dex)对体外培养小梁细胞(Trabecular Meshwork Cells,TMCs)活性的影响。方法 不同浓度Dex作用体外培养的牛小梁细胞，四甲基偶氮唑蓝法（Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT）检测其活性。结果 在一定浓度范围内（10-4~10-6mol/L），地塞米松均可使小梁细胞吸光度值下降，导致有活性的小梁细胞减少，其中10-5mol/L的作用最强。结论 地塞米松可降低体外培养的小梁细胞活性。
【关键词】 地塞米松 小梁细胞 青光眼 MTT法
糖皮质激素性青光眼是糖皮质激素在眼部的并发症之一，其发生与眼部激素浓度有关［1］。青光眼是由眼内房水的分泌和排除失去动态平衡，导致病理性眼压升高，其中，小梁网-作为房水外流主要阻力之一，在青光眼的发生、发展中起不可忽视的作用。本研究基于体外培养牛小梁细胞，采用不同浓度的地塞米松溶液作用于小梁细胞，应用MTT法检测小梁细胞活性。
1 材料与方法
1.1 实验仪器与试剂
1.1.1 主要仪器 MCO-15A型二氧化碳培养箱（日本SANYO公司）、Hbo5o型倒置显微镜（德国ZESS公司）、全自动酶标仪（美国BioTEK ELX808）、低温冰箱（日本 MDF-V5410）、超净工作台（苏州医疗器械厂）、微量移液器（法国GILSON）、自动纯水蒸馏器（上海1810B）。
1.1.2 主要试剂 地塞米松磷酸钠注射液系闽清制药有限公司产品，批号03090814。DMEM培养基、胶原酶III、乙二胺四乙酸、MTT试剂分别是美国GIBCO公司、美国Worthington公司、美国Augus公司和美国SIGMA公司产品，均购自华美生物工程公司，胎牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司。二甲基亚砜溶液购自上海生工工程有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 小梁细胞原代及传代培养 宰杀场取健康新鲜半岁以下的小牛眼，4℃运送至实验室，无菌条件下沿角巩膜缘后4~5mm环形剪巩角膜，无齿镊环形撕去虹膜，去除晶状体。在眼科显微镜下撕去睫状体，将小梁组织剪成大约0.5mm大小，平铺于预先已灭菌的培养皿上，加入20%DMEM培养液，置CO2培养箱中。每周换液2~3次，细胞长满后，加入0.25%胰蛋白酶消化传代。传至第3代细胞形态均匀一致，融合后数量恒定，符合实验要求。
1.2.2 MTT法检测有活性的TMCs 实验分为对照组和不同浓度（10-4、10-5、5×10-5、10-6mol/L）地塞米松各组。将第3代的牛小梁细胞，胰蛋白酶消化制成5×103 个/mm3的细胞悬液，接种于96孔培养板中，20%FBS培养液培养24h，使细胞同步化。吸去培养液，按照实验分组分别加入等量的不同浓度的地塞米松。孵育48h后，加入20μl MTT试剂（终浓度为5mg/ml），继续置于培养箱中培养4h。吸去培养上清液，再加入200μl二甲基亚砜溶液，振荡器轻轻振荡10min后室温下静置5min。于全自动酶标仪上560nm比色测定各组吸光度值。
1.2.3 统计学处理 两组间采用t检验，利用SPSS 11.0统计软件对数据进行统计学处理。
2 结果
2.1 体外培养的小梁细胞的形态观察 小梁细胞为贴壁依赖性细胞。经组织法和细胞悬液接种1d后倒置显微镜下观察，可见细胞贴壁。这些贴壁细胞呈扁平不规则，大小不均，细胞透亮，胞浆丰富，胞体肥大，胞膜清晰，并有长短不一的伪足伸出。3周后，细胞基本融合。融合细胞呈上皮细胞型和成纤维细胞型。传代小梁细胞生长、分裂较快，一般在24h内贴壁，细胞约2周融合长满。传代细胞密度均一、形态一致，符合实验要求。
2.2 MTT法检测Dex 对小梁细胞活性的影响 不同浓度Dex 作用于小梁细胞后，均可使各组的吸光度值降低，表所示：
表1 MTT法检测不同浓度地塞米松对小梁细胞活性的影响（略）
3 讨论
3.1 激素性青光眼的发病机制 糖皮质激素性引起眼压升高与许多因素有关，如患者的易感性［2］、用药剂型、剂量、用药的频率、途径等。其早期眼压的升高是可逆性的，具体的发病机制与原发性开角性青光眼相似，主要表现为房水外流阻力增大，其阻力部位主要存在小梁网。小梁细胞的功能特性、结构特点在青光眼发病和疾病的发展、转归中的意义，近年来日益受到关注。小梁细胞含有糖皮质激素受体，糖皮纸激素正是通过这些受体，作用于小梁细胞及细胞外基质，引起小梁超微结构的改变，包括小梁细胞的坏死［3］和凋亡［4］、小梁束细胞外物质的沉积、小梁内细胞空间的减少，这些改变引起小梁网的狭小、甚至闭塞，导致房水外流阻力增加，眼压增高。
3.2 地塞米松可影响小梁细胞的活性 MTT法是目前检测细胞活性的常用方法，其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。MTT方法的特点是简便、快速、准确性高，在研究中广泛采用。本部分研究将显示，在一定浓度范围内（10-4~10-6mol/L），地塞米松均可使小梁细胞吸光度值降低、导致有活性的小梁细胞减少。本部分研究还发现，10-5mol/lDex导致有活性的小梁细胞减少的作用最强，而10-4mol/和10-6mol/lDex的作用均减弱。说明地塞米松引起TMCs死亡可能存在某一敏感浓度，这是居于我们体外实验的一合理推论。但临床上引起激素性白内障的具体浓度，还有待于我们今后临床上的进一步探索。
参考文献
［1］ Jain R,Kumar B.Immediate and delayed complications of dexamethasone cyclophosphamide pulse(DCP)therapy［J］.Dermatol,2003,30(10):713-718
［2］ Zhang X,Clark AF,Yorio T.Regulation of glucocorticoid responsiveness in glaucomatous trabecular meshwork cells by glucocorticoid receptor-beta［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci,2005,46(12):4607-4616
［3］ Lam SC,Leung YF,Chua KF.Truncation in the TIGR in individuals with and without primary open-angle glaucoma［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci,2000,41(6):1386-1391
［4］ 古亚娟,曾淑君,邱鹏新,等.地塞米松诱导牛眼小梁细胞凋亡的研究［J］.中华眼科杂志,2002,38(5):302-304
作者单位：莆田学院附属医院眼科(福建)
邮 编 351100
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