作者：陆士恒 柳 林 作者单位：200433）中国上海市，第二军医大学第一附属医院眼科
【摘要】 目的：建造视网膜挫伤模型，探讨多奈哌齐对眼挫伤大鼠视网膜保护作用的可能机制。 方法：选2mo龄SD雌性大鼠24只，随机分为为3组，每组8只，正常对照组（A组）、多奈哌齐处理组（B组）和蒸馏水组（C组）。A组不处理，B组和C组用重击法致左眼挫伤。伤后第2d，B组用1g/L的盐酸多奈哌齐5mL/kg灌胃，2次/d，C组用同体积的蒸馏水灌胃。连续给药7 d，各组于第8d取材。应用RTqPCR法检测视网膜组织中Bcl2和Bax mRNA的表达变化。 结果：多奈哌齐组视网膜组织内Bcl2 mRNA的表达水平在挫伤后7d有下降，与正常组相比有显著差性差异（P<0.01），与蒸馏水组相比也有显著差性差异（P<0.05）。与Bcl2的表达相反，多奈哌齐组BaxmRNA的表达显著高于正常组（P<0.01）但是低于蒸馏水组（P<0.05）。结论：多奈哌齐有可能具有保护眼挫伤大鼠视网膜的功能。
【关键词】 眼挫伤 视网膜 大鼠 Bcl2 Bax 凋亡
0引言
盐酸多奈哌齐是第二代胆碱酯酶（ChE）抑制剂，是一种长效的阿尔茨海默病（AD）的对症治疗药，最近有研究表明它具有神经保护作用，本实验通过眼外伤验证多奈哌齐的作用。
1材料和方法
1.1材料 雌性2mo龄SD大鼠24只，质量190～230 （平均219）g，由第二军医大学试验动物中心提供。盐酸多奈哌齐为法国Pfrizer PGM公司产品，卫材（中国）药业有限公司分装。Biorad iQ5 Real Time PCR 扩增仪、SYBR Green（BioRad公司，美国）Eppendof PCR扩增仪（Eppedof公司，德国）；TRIzol试剂盒（Invitrogen公司，美国）；RNasefree DNase I；MMLV反转录酶（日本TaKaRa公司）； PCR产物胶回收试剂盒（美国Omega）；Bcl2，Bax和βactin基因引物（上海生工生物工程有限公司）。
1.2方法 采用仿Allen重击法：制作眼挫伤模型装置,打击棒上端直径9mm，下端接一面直经6mm的圆台，质量120g,材质为不锈钢，外面导向管是1根内径10mm的玻璃管，并自下向上做以厘米为单位的标记。 大鼠随机分为正常组8只（A组）和挫伤组16只，挫伤组分为多奈哌齐组组（B组）、蒸馏水组（C组）、每组8只(所有大鼠均取左眼)。A组不处理，水合氯醛0.3～0.4g/kg，ip注射麻醉满意后，1人用双手扶住大鼠头部及下颌，以保持大鼠左眼朝上，眼眶眶口处于水平位置，下面垫泡沫枕头以缓减对其它器官的冲伤。另1人将打击装置放到鼠眼正上方，导向管与鼠面紧密接触并保持垂直，鼠眼位于导向管中央，打击锤从8cm高度沿导向管垂直落向眼球，造成眼球挫伤。B组1g/L盐酸多奈哌齐5 mg/kg灌胃，2次/d。C组同体积的蒸馏水灌胃，伤后2d给药，连续给药7d 。造模后第8d各组大鼠在水合氯醛麻醉下，经心脏灌流焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的生理盐水，以冲净血液。取出双侧眼球，快速分离出视网膜，置于液氮中冷冻，按照Invitrogen公司 Total RNA Isolation System方法提取总RNA，并用10g/L的琼脂糖电泳和值检测其质量和浓度。为了消除基因组DNA的污染，首先将总RNA用RNasefree DNase I处理，20μL的体系包括1μg 总RNA，2μL 10×buffer，67nka＋RNasefree DNase I和133 nka＋RNA酶抑制剂，37℃ 25min去除DNA，75℃ 10min使酶失活。所有引物都根据其编码区设计（表1）。取经酶切后的等量总RNA，利用MMLV反转录酶和Oligo（dT）primer合成第一链cDNA。Realtime PCR根据QuantiTect SYBR Green PCR 试剂盒手册进行。反应混合液（25μL）预先在95℃放置15min以激活热启动Taq酶，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环。其中内参βactin同样进行Realtime PCR扩增。每次PCR扩增都要采用没有模板的阴性对照。同时进行PCR扩增的时候每个样品，采用两个平行。每个样品的目基因和内参mRNA通过标准曲线进行相对定量。每个样品的目的基因的与内参的比值作为目的基因的mRNA表达。
统计学处理：实验数据采用±s表示，不同组之间的显著性差异通过t检验，置信区间为95％，P<0.05表示差异显著。
2结果
2.1 Bcl2基因的表达 A组Bcl2基因的表达量最高，B组Bcl2基因表达量是A组的0.63倍，C组Bcl2基因的表达量是A组的0.56倍，A组与B组比较有显著差异（P<0.01），B组与C组比较有差异（P<0.05，表1）。
2.2 Bax基因的表达 A组Bax基因的表达量最低，B组Bax基因表达量是A组的2.99倍，C组Bax基因的表达量是A组的3.23倍，A组与B组比较有显著差异（P<0.01），B组与C组比较有显著性差异（P<0.05，表2）。
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