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盐酸多奈哌齐对眼挫伤后大鼠视网膜Bcl2和Bax mRNA表达的调节

http://www.cnophol.com 2009-11-17 9:46:51 中华眼科在线

    作者:陆士恒 柳 林    作者单位:200433)中国上海市,第二军医大学第一附属医院眼科

    【摘要】  目的:建造视网膜挫伤模型,探讨多奈哌齐对眼挫伤大鼠视网膜保护作用的可能机制。 方法:选2mo龄SD雌性大鼠24只,随机分为为3组,每组8只,正常对照组(A组)、多奈哌齐处理组(B组)和蒸馏水组(C组)。A组不处理,B组和C组用重击法致左眼挫伤。伤后第2d,B组用1g/L的盐酸多奈哌齐5mL/kg灌胃,2次/d,C组用同体积的蒸馏水灌胃。连续给药7 d,各组于第8d取材。应用RTqPCR法检测视网膜组织中Bcl2和Bax mRNA的表达变化。 结果:多奈哌齐组视网膜组织内Bcl2 mRNA的表达水平在挫伤后7d有下降,与正常组相比有显著差性差异(P<0.01),与蒸馏水组相比也有显著差性差异(P<0.05)。与Bcl2的表达相反,多奈哌齐组BaxmRNA的表达显著高于正常组(P<0.01)但是低于蒸馏水组(P<0.05)。结论:多奈哌齐有可能具有保护眼挫伤大鼠视网膜的功能。

    【关键词】  眼挫伤 视网膜 大鼠 Bcl2 Bax 凋亡

    0引言

    盐酸多奈哌齐是第二代胆碱酯酶(ChE)抑制剂,是一种长效的阿尔茨海默病(AD)的对症治疗药,最近有研究表明它具有神经保护作用,本实验通过眼外伤验证多奈哌齐的作用。

    1材料和方法

    1.1材料  雌性2mo龄SD大鼠24只,质量190~230 (平均219)g,由第二军医大学试验动物中心提供。盐酸多奈哌齐为法国Pfrizer PGM公司产品,卫材(中国)药业有限公司分装。Biorad iQ5 Real Time PCR 扩增仪、SYBR Green(BioRad公司,美国)Eppendof PCR扩增仪(Eppedof公司,德国);TRIzol试剂盒(Invitrogen公司,美国);RNasefree DNase I;MMLV反转录酶(日本TaKaRa公司); PCR产物胶回收试剂盒(美国Omega);Bcl2,Bax和βactin基因引物(上海生工生物工程有限公司)。

    1.2方法  采用仿Allen重击法:制作眼挫伤模型装置,打击棒上端直径9mm,下端接一面直经6mm的圆台,质量120g,材质为不锈钢,外面导向管是1根内径10mm的玻璃管,并自下向上做以厘米为单位的标记。 大鼠随机分为正常组8只(A组)和挫伤组16只,挫伤组分为多奈哌齐组组(B组)、蒸馏水组(C组)、每组8只(所有大鼠均取左眼)。A组不处理,水合氯醛0.3~0.4g/kg,ip注射麻醉满意后,1人用双手扶住大鼠头部及下颌,以保持大鼠左眼朝上,眼眶眶口处于水平位置,下面垫泡沫枕头以缓减对其它器官的冲伤。另1人将打击装置放到鼠眼正上方,导向管与鼠面紧密接触并保持垂直,鼠眼位于导向管中央,打击锤从8cm高度沿导向管垂直落向眼球,造成眼球挫伤。B组1g/L盐酸多奈哌齐5 mg/kg灌胃,2次/d。C组同体积的蒸馏水灌胃,伤后2d给药,连续给药7d 。造模后第8d各组大鼠在水合氯醛麻醉下,经心脏灌流焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的生理盐水,以冲净血液。取出双侧眼球,快速分离出视网膜,置于液氮中冷冻,按照Invitrogen公司 Total RNA Isolation System方法提取总RNA,并用10g/L的琼脂糖电泳和值检测其质量和浓度。为了消除基因组DNA的污染,首先将总RNA用RNasefree DNase I处理,20μL的体系包括1μg 总RNA,2μL 10×buffer,67nka+RNasefree DNase I和133 nka+RNA酶抑制剂,37℃ 25min去除DNA,75℃ 10min使酶失活。所有引物都根据其编码区设计(表1)。取经酶切后的等量总RNA,利用MMLV反转录酶和Oligo(dT)primer合成第一链cDNA。Realtime PCR根据QuantiTect SYBR Green PCR 试剂盒手册进行。反应混合液(25μL)预先在95℃放置15min以激活热启动Taq酶,然后94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,共40个循环。其中内参βactin同样进行Realtime PCR扩增。每次PCR扩增都要采用没有模板的阴性对照。同时进行PCR扩增的时候每个样品,采用两个平行。每个样品的目基因和内参mRNA通过标准曲线进行相对定量。每个样品的目的基因的与内参的比值作为目的基因的mRNA表达。

    统计学处理:实验数据采用±s表示,不同组之间的显著性差异通过t检验,置信区间为95%,P<0.05表示差异显著。

    2结果

    2.1 Bcl2基因的表达  A组Bcl2基因的表达量最高,B组Bcl2基因表达量是A组的0.63倍,C组Bcl2基因的表达量是A组的0.56倍,A组与B组比较有显著差异(P<0.01),B组与C组比较有差异(P<0.05,表1)。

    2.2 Bax基因的表达  A组Bax基因的表达量最低,B组Bax基因表达量是A组的2.99倍,C组Bax基因的表达量是A组的3.23倍,A组与B组比较有显著差异(P<0.01),B组与C组比较有显著性差异(P<0.05,表2)。

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(来源:互联网)(责编:xhhdm)

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