作者：易如海， 杨立勇， 张声， 高凌云

　　摘要:  目的  探讨核因子κB(NFκB)与糖尿病视网膜病变(DR)的关系。  方法  以链脲佐菌素(STZ)诱导建立糖尿病大鼠模型30只，同时设正常对照大鼠30只。在糖尿病诱导后1，3，6个月时，用免疫组织化学技术评估糖尿病大鼠及相应时间的对照大鼠的视网膜NFκB的活性变化。  结果各糖尿病组与相同病程的对照组比较，NFκB染色阳性细胞的灰度值显著降低(P＜0.05)，表明NFκB的活性显著增高。在糖尿病组中，随着糖尿病病程和视网膜病理改变的发展，NFκB染色阳性细胞的灰度值进行性降低(P＜0.05)。  结论NFκB的活性在糖尿病大鼠的视网膜中显著增强；NFκB可能是DR的重要危险因素，参与DR的病理发展过程。

　　关键词:  糖尿病视网膜病；核因子κB；免疫组织化学

　　糖尿病视网膜病变(DR)目前已成为成人失明的重要原因，但其发病机制尚未完全清楚。近年的研究发现，血管内皮生长因子、细胞间黏附分子1(ICAM1)、内皮素、E选择素等细胞因子在DR的发病中发挥着重要的作用，而核因子κB(NFκB)对上述的许多因子都具有调控作用[14]。因此，研究NFκB在糖尿病状态下视网膜中的活性变化具有重要的意义。笔者采用免疫组织化学技术观察NFκB在不同病程糖尿病大鼠视网膜上的表达和活性变化，以期探讨NFκB在DR发病中的作用。

　　1   材料与方法

　　1.1   大鼠糖尿病模型建立  雄性SD大鼠60只(上海西普尔必凯实验动物有限公司,许可证号：20020006），体质量200～220 g。随机分为糖尿病组30只，以糖尿病诱导后1，3，6个月分为1月组、3月组、6月组，每组各10只；同时设条件匹配的正常对照组30只，分为1月组、3月组和6月组，每组各10只。适应性饲养1周。糖尿病组大鼠以55 mg/kg一次性左下腹腔内注射链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司）溶液，72 h后取尾血测血糖，血糖≥16.7 mmol/L者为糖尿病大鼠。糖尿病组和对照组大鼠每月测一次血糖。

　　1.2  视网膜组织切片制备以过量氯胺酮麻醉处死到期的各组大鼠，立即摘取左侧眼球，分离出视网膜,中性福尔马林固定。进行石蜡包埋，连续切片。

　　1.3   免疫组织化学染色一抗为小鼠抗大鼠的NFκB单克隆抗体（美国SANTA CRUZ公司，克隆号：F6），工作浓度1∶100。SP三步法试剂盒购自北京中山生物技术有限公司，参照试剂盒说明进行免疫组织化学操作。3,3二氨基联苯胺(DAB)染色，苏木精对比染色，中性树胶封固。阴性对照以PBS替代一抗，其余步骤同上。

　　1.4   结果判断NFκB表达：仅细胞质中出现阳性染色。NFκB活化：细胞核内出现阳性染色。每一切片随机选择5个视野，在显微镜下（×40）对图像进行分析，将所得的灰度值总和后取平均数作为统计指标。

　　1.5   统计学处理数据以x±s表示，SPSS 10.0进行统计分析。2组间用t检验，组内比较用方差分析。

　　2  结果
   
　　通过HE染色可见，3月组的糖尿病大鼠视网膜毛细血管扩张，节细胞呈空泡变性；6月组上述病理改变进一步加剧，可见到基底膜分层。
   
　　在对照组，NFκB在视网膜上神经节细胞弱表达，局限于细胞质。在1月组、3月组、6月组的正常大鼠之间，NFκB的表达未见差异，3组的灰度值分别为：（173.03±8.22），（168.34±10.67），（165.03±7.12）。
   
　　在糖尿病组，NFκB除了见于神经节细胞的细胞核外，表达空间还扩大到内核层和外核层的细胞(图1)。糖尿病组视网膜NFκB的灰度值与相对应的对照组相比显著降低(P＜0.05)，1月组、3月组和6月组的NFκB灰度值分别为（155.38±10.01），（142.82±7.88），（109.89±10.81）。在糖尿病组各时间组之间，随着病程的延长，NFκB的灰度值呈进行性下降的趋势(P＜0.05)(图2)，说明糖尿病组NFκB的表达较对照组有显著的提高，并且随着病程的延长NFκB的活性也进一步增强。

　　A:1月组神经节细胞、内核层、外核层细胞核棕黄色;B:6月组神经节细胞、内核层、外核层细胞核深棕黄色

　　图1   糖尿病大鼠核因子κB阳性染色(SP染色  ×40)（略）

　　t（糖尿病诱导后）/月

　　图2  SD大鼠视网膜因子κB灰度值变化（略）

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