作者：胡健 王 强 雷宁玉 任 莉 张 娟 作者单位：滨州医学院附属医院眼科 滨州市 256603
【摘要】 目的 新鲜人羊膜负载构建兔角膜上皮，为全角膜组织工程作基础。方法 采用组织块法培养兔角膜缘干细胞，以新鲜人羊膜为载体，形成单层细胞膜片后用于传代；采用相差显微镜进行形态观察及AE5、p63免疫荧光鉴定。结果 培养24 h，兔角膜缘组织块边缘可见有细胞长出，之后形成“沙滩样”移形带，培养至7～8 d细胞在羊膜上形成单层膜状，细胞透明，边缘整齐，形态呈多样化，以卵圆形和多边形为主；AE5抗体、p63抗体染色阳性细胞比例分别为（41.72±11.35）%、（21.57±6.36）%；2代AE5和p63阳性细胞比例与原代比较，无显著性差异（P﹥0.05）；3代AE5和p63阳性细胞比例与原代比较，差异有统计学意义（P﹤0.05）；但4代AE5阳性细胞比例又明显升高。结论 以新鲜羊膜为载体、采用组织块法培养角膜缘干细胞可获得较好的角膜上皮片，在传代细胞中，3代细胞分化程度最低、增殖能力最强，最适合移植。
【关键词】 角膜缘干细胞；新鲜羊膜；细胞培养
Cultivation of rabbit limbal stem cell on human fresh amnion
HU Jian WANG Qiang LEI Ningyu et al
Department of Ophthalmology, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University，Binzhou 256603
【Abstract】 Objective To produce rabbit corneal epithelium with cultivation of rabbit limbal stem cell on human fresh amnion.Methods Rabbit limbal epithelium was cultured on human fresh amnion by tissue block method. It was passage time when the primary cells formed monolayer cell patch. Keratin 3(AE5) and p63 were detected on the primary and four generation cells with immunofluorescence. Contrast phase microscope was used to observe the appearance of cells.Results Cells outgrew from the limbal tissue block within 24 hours, then ‘sandy beach’ band formed, and confluent monolayer cell patch appeared when cultivated 7～8 days. The positive percentage of AE5 and p63 was (41.72±11.35)% and (21.57±6.36)% respectively in primary cells. Positive percentages of AE5 and p63 were no of statistical difference between the second generation cells and primary cells (P﹥0.05), while there was significant difference between the third generation and primary cells(P﹤0.05), and AE5 positive cells increased in the fourth generation.Conclusion Corneal epithelium is produced with cultivation of rabbit limbal stem cell by method of tissue block on human fresh amnion. Among all generations, the third generation cells are most suitable to be translated, because of the lowest differential degree and the strongest proliferative ability.
【Key words】 limbal stem cells，fresh amnion，cell culture
组织工程构建角膜上皮是组织工程化全角膜的课题之一。角膜缘干细胞是角膜上皮细胞增殖、分化和移行的来源，目前这一观点已经得到公认。种子细胞问题解决后，载体的选择已成为研究重点。本课题组采用新鲜羊膜负载培养角膜缘干细胞，为角膜上皮组织工程的载体选择提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 组织来源：兔眼取自健康纯系新西兰大白兔，雌雄不限，体质量2～2.5 kg，由重庆医科大学动物中心提供，在实验前用0.25％氯霉素滴眼液点眼，4次/日，共3 d。羊膜取自排除肝炎病毒、AIDS病毒及梅毒等传染病的剖腹产妇的胎盘。
1.1.2 主要试剂：DMEM/F12培养液、胎牛血清（美国Hyclone公司），鼠抗兔单克隆AE5抗体（K3抗体）、鼠抗兔单克隆抗体p63（英国Abcam公司），免疫荧光染色试剂盒（Sigma公司），硝酸纤维素膜（北京鼎国生物制品公司），青霉素、链霉素、庆大霉素（上海生物工程技术服务有限公司）。
1.1.3 主要仪器：相差显微镜(Likon UFXⅡ型，OLYMPUS日本)，CO2培养箱(2300型SHELDON美国)，眼科显微手术器材等。
1.2 方法
1.2.1 新鲜羊膜的制备：①羊膜取材：含抗生素（4 000 U/ml的庆大霉素、青霉素500 U/ml、链霉素500 μg/ml）PBS洗去胎盘的血凝块，钝性剥离羊膜，使其与绒毛膜分离，同时用含抗生素的PBS冲洗干净后浸泡20 min，上皮面朝上平铺于硝酸纤维素膜上。将上述附有羊膜的纸片修剪成2.5 cm×2.5 cm的小块。PBS冲洗2次，置于细胞培养板中DMEM/F12培养液（含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，无血清）浸泡备用，所制羊膜均于取材后12 h内使用。②羊膜去上皮：含0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA的消化液37℃消化40 min，用细胞刮刀轻轻刮除上皮细胞，PBS清洗2次，相差显微镜下确认上皮细胞全部清除。上皮面朝上铺于盖玻片（22 mm×22 mm）上置于6孔培养板内。
1.2.2 兔角膜缘干细胞的原代培养（组织块法培养）：空气栓塞处死白兔，无菌条件下摘除眼球，去除角膜缘周围的附属组织，用含抗生素的PBS清洗3次，切取角膜缘组织，剪成1 mm3组织块。用含0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA的消化液消化15～20 min)，500 r/min离心后，弃去消化液，PBS清洗2次，将组织块置于羊膜上，每孔3块，间距0.5 cm，无菌静置10 min。含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和20%胎牛血清的DMEM/F12培养液，37℃、5%CO2培养，3 d换液，之后每2 d换液1次，形成单层细胞膜片后用于鉴定或传代。
1.2.3 角膜缘干细胞的传代纯化：相差显微镜下观察，待组织块生出的细胞形成单层膜片后，一般为8 d左右，将组织块取出置于另一羊膜上继续培养。PBS洗涤2次，0.25%胰蛋白酶37℃消化2～3 min，含血清细胞培养液中止消化，轻轻吹打下的细胞收集入离心管，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入细胞培养液制成细胞悬液，调整浓度至1×105copies/ml，接种于羊膜上，隔日换液，每2 d换液1次。如此传代3次，去除纤维细胞。待细胞基本长满后用于鉴定和移植。
1.2.4 角膜缘干细胞的鉴定［１］：免疫荧光鉴定：吸尽培养液，加入1 ml固定液，固定10 min。去固定液，用洗涤液洗3次，每次3～5 min，吸尽液体。用封闭液封闭60 min，在摇床上轻轻摇动。去封闭液，用稀释的一抗作用60 min，可以在摇床上轻轻摇动。4℃作用过夜。去除一抗，用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5 min。去除洗涤液，加入1 ml稀释好的荧光标记的二抗作用60 min，可以在摇床上轻轻摇动。回收荧光标记的二抗，用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5 min。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，在荧光显微镜下观察荧光。
1.3 统计学方法 本实验数据均使用SPSS14.0统计软件进行分析，传代细胞与原代细胞AE5和p63抗体染色阳性比例间比较采用χ2检验，P﹤0.05为差异有统计学意义。
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