作者：路西林，薛会敏，赵朝贤，杨建峰 作者单位：056001 邯郸市第三医院检验科(路西林、薛会敏)； 056002 河北工程大学医学院生化教研室(赵朝贤)； 056001 邯郸市邯钢医院检验科(杨建峰)
【摘要】 目的 探讨聚合酶链反应(PCR)快速检测在真菌性角膜溃疡诊断中的价值。方法 以源于医学条件致病性真菌18srRNA基因保守区的一对寡核苷酸序列为通用引物，对临床拟诊为真菌性角膜溃疡的36例标本进行PCR检测，并与培养方法进行对比。结果 在400bp处出现DNA扩增带者为阳性。36份临床标本的真菌培养阳性率为58.3%，而经PCR扩增阳性率为86.1%，PCR扩增准确性为72.2%，敏感性为100.0%，特异性为33.3%。结论 真菌通用引物进行PCR反应检测真菌性角膜溃疡速度快、阳性率高，有助于真菌性角膜溃疡的快速诊断。
【关键词】 聚合酶链反应；角膜溃疡，真菌性；诊断
Applied polymerase chain reaction detecting fungal corneal ulcer LU Xilin,XUE Huimin,ZHAO Chaoxian,et al.Department of Clinical Laboratory,Handan Third Hospital,Handan 056001,China
【Abstract】 Objective To establish a method for rapid detection of clinical suspect fungal corneal ulcer by polymerase chain reaction(PCR).Methods A pair of oligonucleotide sequences,which was bases on the conserved region of 18srRNA shared by medically important conditioned fungal,was used as the general primers to amplify the DNAs from clinical suspect fungal corneal ulcer in a PCR assay,and the result was contrasted with culture.Results A 400bp specific DNA product was successfully amplified. The positive rate of fungi culture among 36 clinical specimens was 58.3%, while that of PCR amplification was 86.1%.In addition,the accuracy of PCR method in this study was 72.2%,the sensitivity was 100%,and the specialty was 33.3%.Conclusion PCR with the general primers is suitable for rapid detection of fungal corneal ulcer because of quickness and high positive rate.
【Key words】 Polymerase chain reaction;Corneal ulcer,fungal;Diagnosis
真菌性角膜溃疡是一种严重的真菌感染性角膜病，致盲率高，近年来随着广谱抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂的广泛应用，真菌性角膜溃疡的发病率呈上升趋势［1，2］，在我国某些地区已上升为角膜感染的首位［3］。许多病例特别是不典型病例早期明确诊断较为困难,进而延误了治疗，造成角膜穿孔、眼球摘除，因此寻找快速、准确的实验室诊断方法对临床早期诊断具有重要意义。真菌培养方法鉴定真菌费时费力，远远不能满足临床诊断、治疗的需要。为此，我们采用一对源于医学条件致病性真菌18srRNA保守区的寡核苷酸序列为通用引物，以聚合酶链反应(PCR)技术对36例临床上拟诊为真菌感染病例的标本进行检测，并与培养方法进行对比，报道如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料 选择2007年12月—2008年11月来我院就诊的被临床拟诊为真菌性角膜溃疡患者36例，男21例，女15例；年龄16～81岁，中位数42.5岁；病程4d～3个月；左眼20只，右眼16只。
1.2 培养方法 所有患者均经1%丁卡因眼角膜局部表面麻醉，在无菌操作下用刮铲刮取角膜溃疡边缘和/或溃疡底部的菌丝苔被2份，1份做培养，在无菌操作下接种于沙氏琼脂培养基斜面，置于25～28℃、湿度40%～50%的温箱中孵育培养7～10 d，有真菌生长者根据菌落特征、颜色以及乳酸酚棉蓝染色镜检菌丝、孢子特征进行菌属鉴定；另1份做PCR检测。
1.3 PCR方法
1.3.1 DNA的制备： 刮取的另一份病灶组织放入已加入500 μl PBS的1.5 ml离心管内, 然后加入100 U溶壁酶(lyticase),37℃温育1 h，6 000×g离心1 min，弃上清，然后按照Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒(由杭州博日科技有限公司提供)说明书操作，提取的DNA做PCR［4］。
1.3.2 PCR检测： 真菌通用引物采用A1(5'ATTCCTCGTTGAAGAGCA3')和A2(5'ACTCAACACGGGGAAACT3')(由上海生工生物工程公司合成)，PCR总体积为25 μl，其中2×Taq PCR master mix(由天艮生化科技有限公司提供)12.5 μl，真菌上、下游引物各1 μl，DNA模板6 μl，体积不足部分用无菌双蒸馏水补足。PCR反应条件为：94℃预变性5 min，94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环，72℃延伸5 min。反应结束后，样品在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色。紫外灯下观察，凝胶成像系统下照相记录结果，在整个实验过程中均设立阳性、阴性对照，并严格按照操作规程进行操作［5］。临床标本经PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳在400 bp处出现DNA扩增带者为阳性。如图1。
1.4 统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件进行统计分析，计数资料以率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
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