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1.2.4 组织病理学观察
分别对移植术后第1、第2、第3、第4和第6周制备的切片脱蜡至水，常规HE(苏木精、伊红)和PAS染色(示糖原)，用光镜观察。
1.2.5 间接免疫荧光细胞化学染色
分别对移植术后第1、第2、第3、第4和第6周制备的切片脱蜡至水；新鲜配制的3% H2O2室温处理；0.5% Triton X-100打孔； 按照试剂盒的通用方法依次滴加正常血清封闭液、一抗AE1（阴性对照加入PBS）、FITC标记的羊抗鼠单克隆抗体IgG、SABC-FITC，甘油封片。用荧光显微镜观察并摄像记录。
1.2.6 免疫组化法检测PCNA的表达
分别对移植术后第1、第2、第3、第4和第6周制备的切片脱蜡至水；新鲜配制的3%H2O2室温处理；0.5% Triton X-100打孔；按照试剂盒的通用方法依次滴加正常血清封闭液、一抗PCNA（阴性对照加入PBS）、羊抗鼠单克隆抗体IgG、SABC；DAB显色，蒸馏水洗涤；苏木素复染；脱水，透明，封片。用光镜观察并摄像记录。
1.2.7 超微结构的观察
在移植术后第1、第2、第3、第4和第6周，分别制备扫描电镜标本和透射电镜标本，观察实验兔角膜表面细胞的超微结构。
2 结果
2.1 人MSCs在人羊膜上的分化情况
人MSCs接种在羊膜的上皮面后很快贴附生长，细胞呈梭形，胞核大，细胞活力好，48 h后融合成单层，第4天可见人MSCs在羊膜的基质面密集生长（见图1）。经免疫组化检测和流式细胞仪结果显示，羊膜上MSCs的表面标志与未接种于羊膜上的MSCs细胞一致。
2.2 羊膜负载人MSCs移植到兔角膜缘干细胞缺损动物模型后的观察
羊膜平贴角膜表面，无感染迹象，第12天左右，两组羊膜开始出现部分融解，由中央部开始，第28天后角膜上皮愈合，基本透明，浅层角膜可见轻度混浊，角膜周边有新生血管长进，实验组角膜比对照组透明。
2.3 临床观察和组织学检查
实验组角膜基质无水肿增厚，上皮层生长至第2周时已开始形成复层，第6周时已接近正常角膜上皮层厚度(见图2)；对照组上皮层不够光滑、平整，易脱落。实验组兔角膜PAS染色为阴性（见图3），而对照组为阳性（见图4)。
2.4 免疫组织化学检查
在移植术后第4周，行免疫荧光细胞化学染色检查，在实验组中可见AE1染色阳性的角膜表层细胞（见图5)；并且在人MSCs移植术后第6周，免疫组化法在实验组中可见PCNA表达阳性的角膜表层细胞（见图6)。而对照组均为阴性。
2.5 超微结构的观察
在移植术后第6周的实验组中，透射电镜可见细胞器丰富，细胞核呈圆形或椭圆形，体积较大，核周围有大量的张力丝，细胞间有桥粒连接（见图7）；扫描电镜可见细胞呈扁平不规则形状，表面有微绒毛和突起（见图8）。而对照组电镜观察未见以上明显的角膜上皮样细胞特征。
3 讨论
近年来，干细胞研究迅猛发展，为组织再生的基础研究与临床治疗带来了长足的进展。其中骨髓间充质干细胞（MSCs）取材方便，易于分离纯化，体外培养可以多次传代并保持分化能力，具有免疫赦免的特性和多胚层分化潜能，具有特殊的优势[4]，有望应用于多种疾病的临床治疗[5]。最近，国外研究人员通过骨髓移植实验发现MSCs在体内可分化为表皮细胞[2，6]；国内方利君等研究表明：MSCs在体外可诱导分化为上皮细胞，在体内皮肤微环境下也具有分化为表皮细胞的潜能[7-8]。但是MSCs分化为不同类型细胞的机制目前仍不清楚，目前大多数学者认为其分化方向与其周围的微环境密切相关。
本研究将人MSCs接种到羊膜上培养4 d后，经免疫组化和流式细胞仪检测人MSCs表面标志未发生改变，说明羊膜对 MSCs无明显诱导分化作用，可作为MSCs移植的良好载体。临床观察和组织学检查的结果表明，人MSCs在兔角膜缘干细胞缺损的动物模型中发挥类似角膜缘干细胞的功能，使角膜缘干细胞缺损的动物模型角膜上皮化，阻止角膜结膜化（PAS染色阴性）。
单克隆抗体AE1对角膜上皮中相对分子质量为48000的角蛋白具有高亲和力[9]，本研究AE1免疫荧光反应胞浆染色阳性较强，提示兔角膜缘干细胞缺损的动物模型的角膜表层细胞具有角膜上皮细胞特性。单克隆抗体PCNA是一种核内蛋白，在细胞周期中，PCNA于G1期开始积聚，S期达最大量，G2/M期减少，在正常组织中，PCNA阳性细胞仅局限于有增殖能力的区域[10]。本研究采用Anti-PCNA单克隆抗体对经人MSCs治疗的兔角膜缘干细胞缺损的动物模型的角膜表层细胞进行免疫荧光染色，结果证明大量细胞核呈阳性，提示此时大部分细胞具有高增殖能力。
电镜下观察经人MSCs移植治疗的兔角膜缘干细胞缺损的动物模型的角膜表层细胞体积较小，核染色深，核仁明显增大，核附近张力丝丰富，细胞表面可见微绒毛，细胞间可见桥粒连接[11-12]。本实验扫描电镜可见细胞呈扁平不规则形状，表面有微绒毛和突起。透射电镜可见细胞器丰富，细胞核呈圆形或椭圆形，体积较大，核周围有大量的张力丝，细胞间有桥粒连接。以上表明，从超微结构上看，经人MSCs治疗的兔角膜缘干细胞缺损的动物模型的角膜表层细胞符合角膜上皮细胞的特性。
本研究采用人MSCs移植到兔角膜基质，属于异种移植，但人MSCs和角膜处于免疫学上相对的赦免地位[4]，故人MSCs移植到兔角膜基质后短期内能存活。本实验仅观察MSCs在移植后6周内能存活和增殖，其长期的转归有待于进一步的观察研究。
综上所述，人MSCs在兔角膜缘干细胞缺损的动物模型中能够被诱导分化为角膜上皮细胞，从而实现将 MSCs作为角膜上皮细胞种子细胞这一目标，这有待于进一步的深入研究。
【参考文献】
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[8] 方利君，付小兵，王玉新，等. 体外诱导骨髓间充质干细胞分化为上皮细胞的研究[J]. 中华实验外科杂志，2004，21(2)：171-172.
[9] 蒋自培，朱美玲，孔丽萍，等. 体外兔胚胎成纤维细胞为饲养层克隆兔角膜缘干细胞[J]. 眼科研究，2005，23（4）：354-357.
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