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2 结果
2.1 TEHCE的体外重建
HCE种子细胞接种至mdAM上之后，逐渐开始贴膜伸展，细胞形态多为多角形，15h后已接近形成细胞单层（图1A），30h后已形成完整的细胞单层，即体外重建的TEHCE（图1B）。利用网格目微尺对TEHCE进行细胞计数的结果显示，TEHCE单层的细胞密度约为3413/mm2。
2.2 TEHCE的形态结构
对体外重建TEHCE形态结构的检测结果显示，冰冻切片中的种子细胞在载体支架上形成了连续的细胞单层，且种子细胞与载体支架结合状态紧密（图2A）；茜素红染色中的HCE种子细胞在mdAM上多为多角形，细胞之间形成了广泛的细胞连接，形成了HCE样的紧密细胞单层（图2B）；扫描电镜下的种子细胞图1 重建组织工程人角膜内皮种子细胞 A：重建15h；B：重建30h。
在载体支架上形成了完整的细胞单层，细胞形态多为多角形内皮样（图2C）；透射电镜下的种子细胞紧密结合在载体支架上，细胞之间以及细胞与载体支架之间形成了广泛的细胞连接（图2D），种子细胞在超微结构上与在体HCE细胞的相似且含有大量的线粒体（图2E）。
2.3 连接蛋白的表达
单层种子细胞仍保持有ZO1、N钙粘蛋白、间隙连接蛋白43和整联蛋白αv/β5的阳性表达（图3）。证实体外重建TEHCE的种子细胞确实具有形成细胞细胞以及细胞dAM间细胞连接的能力。
3讨论
角膜内皮细胞在体外培养过程中能否保持六角形或多角形细胞形态，是判定体外培养细胞是否仍具有角膜内皮细胞固有属性的重要依据之一，也是其能否形成完整细胞单层和行使角膜内皮功能的前提[2，3，11]。上述C3B单克隆细胞株的多角形细胞形态表明，所得C3B单克隆细胞株符合作用TEHCE种子细胞的条件，可以用于TEHCE的体外重建。细胞系的一个重要特征就是其染色体数目出现了非整倍性，也是鉴定角膜内皮细胞系的一个主要指标[2，3]。染色体数目的非整倍性由于丢失或增加了某些染色体，致使非整倍体细胞的染色体基因出现了减少或增多，因而会引起这些细胞基因表达的异常，最终引起细胞表型和功能发生一定程度的异常。可见，出现染色体非整倍性的HCE细胞系无法直接作用TEHCE的种子细胞，因为TEHCE的种子细胞必须长期保持正常功能才能确保TEHCE在体内长期稳定发挥正常的生物学功能。我们从人角膜内皮细胞系中筛选出的2n=46且核型正常的C3B单克隆细胞株，可以用于在体内长期稳定发挥正常功能TEHCE的体外重建。人角膜内皮是紧密结合在后弹力层上的由扁平六角形角膜内皮细胞镶嵌而成的一个细胞单层，且角膜内皮细胞的形态及其镶嵌性也是维持角膜内皮层的形态结构及其功能的重要因素。虽然在人角膜内皮中也存在有一定比例的非六角形细胞，但主要是由于角膜内皮细胞失去分裂能力引起细胞的逐年减少造成的[12]。本文HCE种子细胞在dAM上的细胞形态多为多角形且30h后便可形成紧密细胞单层的结果表明，体外重建的TEHCE具有类似HCE的形态。此外，TEHCE单层约3413/mm2的细胞密度相当于10～11岁儿童HCE的细胞密度，说明所重建的TEHCE非常“年轻”，可确保移植后长期行使HCE的功能。至今还未见到体外重建TEHCE的细胞密度超过3400/mm2的研究报道。人角膜内皮由扁平六角形角膜内皮细胞镶嵌而成的一个完整细胞单层，其所形成的屏障具有介导角膜内表面溶质和水运输的功能，在维持角膜透明和角膜厚度中具有必不可少的作用。因此，细胞之间能否形成各种细胞连接进而形成完整的内皮单层，是判定HCE细胞能否形成内皮屏障和发挥泵功能的重要指标之一[13]。我们对TEHCE的冰冻切片、茜素红染色、扫描电镜和透射电镜观察的结果表明，TEHCE中种子细胞形成了完整连续的内皮单层，细胞形态为内皮样多角形，细胞之间以及细胞与dAM之间均形成了广泛的细胞连接，种子细胞在超微结构上与在体HCE细胞相似并含有大量的线粒体。该研究结论与对在体HCE细胞的研究结果是一致的。此外，TEHCE种子细胞具有ZO1、N钙黏蛋白、间隙连接蛋白43和整联蛋白αv/β5阳性表达的免疫荧光检测结果，进一步证实了TEHCE种子细胞不仅具有形成细胞间封闭连接、锚定连接和通讯连接的潜能，而且还具有形成细胞与dAM间锚定连接的潜能。上述研究结果，结合我们前文关于TEHCE移植新西兰兔角膜持续维持透明39d的报道[11]，证实体外重建的具有类似在体HCE形态和结构的TEHCE具有发挥角膜内皮屏障和泵功能的能力，这也是可使移植兔眼角膜保持正常厚度和组织结构进而长期维持角膜透明的主要原因[13]。
综上所述，我们体外重建的TEHCE不仅与在体HCE相似的形态结构，而且还能发挥正常的HCE功能，有望作为HCE的结构和功能替代物，用于角膜内皮失代偿和角膜内皮盲的临床移植和治疗。
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