|
3 讨论
基因转染正逐渐成为各种人类疾病病因研究和临床治疗中重要的手段与策略。许多研究者一直都在致力于寻找效率更高而毒性更低的基因转染靶细胞的方法。Müller细胞是视网膜的主要神经胶质细胞,具有维持视网膜正常结构、营养视网膜神经元、参与调节神经突触传递、构成血视网膜屏障等多种生理功能。此外，许多研究还表明Müller细胞在例如青光眼、增生性玻璃体视网膜病变、视网膜脱离、增生性糖尿病视网膜病变等缺氧缺血性视网膜病变的发生发展中起重要作用, 包括可分泌多种生长因子, 影响视网膜的代谢状况, 参与视网膜神经细胞的损伤过程等[1]。由于Müller细胞在视网膜的病理、生理过程中的特殊作用,Müller细胞正逐渐成为眼科病因研究及治疗领域的重要靶细胞。而有关Müller细胞作为靶细胞进行的基因转染及比较研究还为之甚少。我们首先选择经典的Müller细胞培养方法进行细胞培养，结果发现培养的细胞均具有Müller细胞的一般形态。谷氨酸转运体GLAST和谷氨酰胺合成酶GS均是视网膜Müller细胞公认的细胞标记物。通过对培养的细胞进行以上两种抗体的免疫荧光染色，结果可以证实我们培养的视网膜Müller细胞纯度可达95%以上。目前将外源基因导入真核细胞的方法有很多种,大体可分为两大类:病毒转染法和非病毒转染法。病毒转染法具有很高的转染效率,但其存在安全和技术方面的缺点，例如携带的基因长度有限、可能引起错误的免疫应答与毒性反应、可能影响转染细胞的增殖与分化，具有潜在的致癌性等，从而限制了病毒转染法在基因治疗方面的广泛应用[5,6]。而非病毒转染法被认为是更安全和更适合于临床应用的转染方法，主要包括磷酸钙沉淀法、DEAE葡萄糖法、脂质体转染法和电穿孔法等。我们选择采用由Lipofectamine 2000介导的脂质体转染法和电穿孔转染法分别将PEGFPN1质粒转染入视网膜Müller细胞。脂质体法是一种化学方法，主要是通过阳离子脂质体试剂与靶DNA的磷酸骨架结合生成复合物而通过细胞膜的，由于细胞内屏障作用往往脂质体法转染效率并不高[7]；而电穿孔法则是利用脉冲电场在细胞膜上形成孔洞,从而使外源基因进入细胞的一种物理方法。大量对哺乳动物细胞的体外基因转移实验均显示电穿孔法较脂质体转染法具有更高效的转染效率[8]。我们的实验也同样证明，脂质体和电穿孔法均能使PEGFPN1质粒进入Müller细胞,之后利用Müller细胞中转录及翻译所需的酶表达EGFP。随着进入Müller细胞内的PEGFPN1质粒数量逐步增多,细胞内EGFP的表达逐渐增多,于转染后48h出现EGFP表达高峰。此时电穿孔法转染效率明显高于脂质体转染法，约为后者的3倍。随后EGFP表达量逐渐下降，至转染后7d，脂质体法转染组仅见极少量EGFP荧光表达而电穿孔组荧光表达可一直持续到转染后2wk以上，其可能原因为DNA/脂质体复合物对细胞有毒性作用，当进入细胞内的DNA量增加以及DNA/脂质体复合物作用时间延长时,细胞毒性也逐渐加重, 细胞存活率下降, 细胞转染率随之下降[9]。我们是参照Webster等[4]电转大脑小胶质细胞的方法来进行Müller细胞电穿孔转染的，如后期再优化转染参数和方法，将可能得到更高的转染效率。另外，我们的实验还发现转染24h后,两组Müller细胞均有一部分变圆漂浮死亡，说明两种转染方法均具有一定的细胞毒性作用，而对两者细胞存活率及细胞功能改变等的比较还有待我们的进一步研究。
目前有关电穿孔法介导基因转染视网膜Müller细胞的研究还鲜有报道，而我们通过实验证明脂质体法和电穿孔法均能有效的将外源性DNA转移入视网膜Müller细胞内，并且电穿孔法较脂质体法的转染效率更强、基因表达时间更长。这将可能为未来开展的视网膜Müller细胞基因转染研究和基因治疗临床应用提供更好更新的手段。
【参考文献】
1 Bringmann A, Pannicke T, Grosche J, et al. Müller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res 2006；25（4）:397424
2 Hicks D, Courtois Y. The growth and behaviour of rat retinal Müller cells in vitro. 1. An improved method for isolation and culture. Exp Eye
Res 1990；51（2）:119129
3 Sarthy VP, Brodjian SJ, Dutt K, et al. Establishment and characterization of a retinal Müller cell line. Invest Ophthalmol Vis Sci 1998；39（1）:212216
4 Webster SD, Park M, Fonseca MI, et al. Structural and functional evidence for microglial expression of C1qR(P),the C1q receptor that enhances phagocytosis. J Leukoc Biol 2000；67（1）:109116
5 Yang Y, Nunes FA, Berencsi K, et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1deleted adenoviruses for gene therapy. Proc Natl Acad
Sci USA 1994；91（10）:44074411
6 Imai E, Akaqi Y, Isaka Y. Towards gene therapy for retinal diseases. Nephrologie 1998；19（7）:397402
7 Ma H, Liu Q, Diamond SL, et al. Mouse embryonic stem cells efficiently lipofected with nuclear localization peptide result in a high yield of chimeric mice and retain germline transmission potency. Methods 2004；33（2）:113120
8 Micka B, Trojaneck B, Niemitz S, et al. Comparison of nonviral transfection methods in melanoma cell primary cultures. Cytokine 2000；12（6）:828833
9 钱锋，肖成组.脂质体法和电穿孔法转染哺乳动物细胞研究.生物化学与生物物理进展1999；26（3）：289291
上一页 [1] [2] |
