【摘要】 目的：探讨活血利水法对外伤性增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)纤维连接蛋白信使核糖核酸(FNmRNA)的影响。方法：用兔眼后节穿通伤加注入血浆法制备PVR模型，利用免疫组化法对正常组、模型组、活血利水组、活血化瘀组、利水明目组PVR中的玻璃体腔增殖膜FNmRNA进行检测。结果：活血利水组增殖膜中FNmRNA的阳性表达低于模型组、活血化瘀组和利水明目组(P<0.05)。结论：活血利水法能够降低PVR增殖膜中FNmRNA的阳性表达，抑制PVR的发生发展。
【关键词】 活血利水法;散血明目片;增生性玻璃体视网膜病变;纤维连接蛋白信使核糖核酸
Effect of huoxuelishui method on expression of fibronection messenger ribonucleic acid in traumatic rabbit eye with proliferative vitreoretinopathy
Ji Chen, QingHua Peng，YanFei Xing，MeiLin Fu
Foundation items: Natural Science Foundation of Hunan Province, China (No.02JJY2035 );Project of Scientific Research Fund of Hunan Provincial Science and Technology Department, China (No.02SSY3096 )
Key Discipline of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan Province, China; Department of Ophthalmology, Maternal and Children Health Hosptial of Yuhua District, Nanjing 210012, Jiangsu Province, China; Department of Ophthalmology, the Hospital of Traditional Chinese Medicine of Jiading District, Shanghai 201800, China; Department of Ophthalmology, Jili Hospital of Liuyang, Liuyang 410300, Hunan Province, China
Abstract
AIM: To study the effect of huoxuelishui method on expression of fibronection messenger ribonucleic acid (FNmRNA) in traumatic rabbit eye with proliferative vitreoretinopathy(PVR).
METHODS：Experimental PVR models were induced by posterior penetrating eye and infusing plateletrich plasma(PRP) into the central vitreous cavity. The positive expression of FNmRNA in the proliferative membranes were examined by the immunohistochemica SABC.
RESULTS: Compared with normal control group and other control groups，the positive expression of FNmRNA was lower in sanxuemingmu group (P<0.05).
CONCLUSION: Huoxuelishui method can decrease the positive expression of FNmRNA from the proliferative membranes and inhibit the development of PVR.
KEYWORDS: huoxuelishui method;sanxuemingmu tablet;proliferative vitreoretinopathy; fibronection messenger ribonucleic acid
0引言
增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是指在裂孔源性视网膜脱离或视网膜复位术后，由于视网膜色素上皮(RPE)细胞和神经胶质细胞的增生和收缩，造成牵拉性视网膜脱离的病变。由于眼球穿通伤后也可因过度的眼内纤维组织增生引起牵拉性视网膜脱离，所以称为外伤性PVR;而因裂孔源性视网膜脱离发生者则称为“特发性PVR”。我们在多年的临床实践中，自拟了具有活血通脉、利水明目作用的中药复方，并按现代制剂制备工艺制成散血明目片，用于治疗玻璃体积血等眼病[1]。本课题旨在通过对兔实验性外伤性PVR模型采用活血利水法(服散血明目片)、活血化瘀法(服止血去瘀明目片)、利水明目法(服猪苓散)治疗后，对增殖膜纤维连接蛋白信使核糖核酸(FNmRNA)指标进行对比观察，进一步阐明活血利水法(散血明目片)抑制外伤性PVR的作用及其机制。
1材料和方法
1.1材料 日本大耳白兔40只，雌雄各半，体质量2.0～2.5kg，由湖南中医药大学动物实验中心提供。散血明目片(由三七、酒大黄、蒲黄、猪苓、防己、地龙、白茅根等活血通脉、利水明目中药按现代制剂制备工艺制成，0.3g/片，选用同一批号药物，批号：020624)，由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。使用时研成粉末，温开水混合，浓度为120g/L。止血去瘀明目片(由丹参、三七、赤芍、地黄、大黄、牡丹皮、墨旱莲、茺蔚子、毛冬青等制成，0.3g/片，选用同一批号的药物。陕西摩美得制药有限公司提供)，使用时研成粉末，温开水混合，浓度为120g/L。猪苓散加减(猪苓10g、泽泻10g、茯苓15g、阿胶10g(烊)、滑石10g、车前子15g)，使用时煎成汤剂，浓度为100mL含生药130g。兔FN原位杂交检测盒：购自武汉博士德公司。
1.2方法 大耳白兔40只，随机抽取8兔8眼作为空白组(A组)，其余32兔32眼造成右眼外伤性PVR模型，并随机分成模型组(B组)、活血利水组(C组、用散血明目片)、活血化瘀组(D组、用止血去瘀明目片)、利水明目组(E组、用猪苓散)，每组8兔8眼。富含血小板的血浆(PRP)的制备采用含38g/L枸橼酸钠的玻璃离心管收集健康日本大耳白兔耳缘静脉血(静脉血与枸橼酸钠体积比为9∶1)，轻轻摇动混匀，室温下以50g之离心力离心10min，取上1/3之上清液，进行血小板计数，获得血小板浓度为(5～10)×105/mL的血浆，即PRP〔2〕。按万光明法[3]制作外伤性实验性PVR模型：大耳白兔耳缘静脉注射乌拉坦4mL/kg。每兔选右眼为实验眼，颞上方注入透明质酸酶0.1mL并反复抽吸，再分离3∶00～9∶00的球结膜和筋膜，在角膜缘后4mm处用巩膜穿刺刀刺向玻璃体中心部，勿伤及晶状体及周边视网膜，用剪刀向两侧扩大切口，伤口与视网膜平行达8mm。轻压眼球，将脱离的玻璃体剪除，用80尼龙线间断缝合切口。玻璃体腔中央注入0.1mL的PRP(约含50000个血小板)。术毕予球结膜下抗菌消炎处理。造模后1wk内用3g/L诺氟沙星滴眼药滴右眼，3次/d;托吡咔胺滴眼液滴右眼，3次/d。造模后3d开始给药，A组(空白组)与B组(模型组)均予温开水灌胃，5mL/kg，2次/d。C组(活血化瘀组)予止血去瘀明目片混悬液灌胃，每千克体质量0.12g/mL，2次/d。D组(利水明目组)予猪苓散汤剂灌胃每千克体质量1.3g/mL(每mL含生药1.3g)，2次/d。E组(活血利水组)予散血明目片混悬液，按每千克体质量0.12g/mL灌胃，2次/d。均相当于成人剂量。各组均灌胃30d。用直接检眼镜检查，观察PVR分级，采用Weiss的评级方法，将病变分为0～4共六级。0级：无增生;0.5级：玻璃体勉强可见增生痕迹;1级：细小的增生束，但无真正的条索形成;2级：有浓厚的增生束，但无真正的增生条索形成;3级：有细薄的增生条索;4级：有浓厚的增生条索。造模30d后行眼球摘除术，在上极象限作球冠形开窗，观察增殖膜分级情况后，剔除角膜和晶状体，取眼球壁，小心剥离视网膜及增殖膜组织，立即置于40g/L的戊二醛溶液中，保存于4℃下固定，固定液为40g/L多聚甲醛或0.1mol/L PBS(pH7.0～7.6)，含有1/1000 DEPC。固定1h即可，常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6μm。石蜡切片经常规脱蜡和水化。300mL/L H2O21份+蒸馏水10份混合，室温5～10min以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。切片上滴加30g/L柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1mL 30g/L柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶后混匀)，37℃或室温消化20min。用PBS洗3次×5min。蒸馏水洗1次。室温下用固定液10g/L多聚甲醛或0.1mol/L PBS(pH7.2～7.6，内含有1/1000 DEPC)固定10min。蒸馏水洗涤3次。干的杂交盒底部加200mL/L甘油20mL以保持湿度。按每张切片20μL加预杂交液。恒温箱38～42℃放置3h。吸取多余液体，不洗。将保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱40℃杂交过夜。37℃左右水温的2×SSC洗涤5min×2次;37℃ 0.5×SSC洗涤15min×1次; 37℃ 0.2×SSC洗涤15min×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15min×1～2次)。37℃ 30min。滴加封闭液，甩去多余液体，不洗。滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加SABC，滴加生物素化过氧化物酶，每次用PBS洗5min×4次。DAB显色，复染，乙醇脱水，二甲苯透明，封片，测定增殖膜FNmRNA。光镜下胞质呈黄色或棕黄色颗粒者为阳性。用显微图像分析仪对切片进行图像分析，所有切片均在同一放大倍数(×400)及同一光强度下分析，测量阳性染色区域，每例动物测10张切片，取平均值。根据阳性细胞比例将染色结果评定为4级：阴性()，为阳性细胞计数<5%;弱阳性(+)，为5%～30%;阳性(++)，为31%～60%;强阳性(+++)，为>60%。观察指标：(1)平均光密度(AOD);(2)平均灰度值(AG，系统设定白色最大灰度为256，黑色最小灰度为0)。实验数据以平均值±标准差(±s)表示。
统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件包的秩和检验及方差分析，计数资料用秩和检验，计量资料采用±s表示，行方差分析。
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