作者：许志洋,姚家奇,刘庆淮,李建民
作者单位：（210029）中国江苏省南京市，南京医科大学1细胞生物学系；2中心实验室；3（210029）中国江苏省南京市，南京医科大学第一附医院眼科
【摘要】目的：建立检测17AAG对人RPE细胞不同处理条件下mRNA的SYBR Green实时PCR方法,观察17AAG对人RPE细胞中Akt，Raf，Hsp90，Hsp70基因表达的调控。方法：体外培养人RPE细胞株。当加入处理因素17AAG并作用不同浓度及时间梯度后,收集细胞,抽提RNA进行反转录。同时根据Akt，Raf，Hsp90，Hsp70的基因序列,设计Akt1，Raf1，Hsp90，Hsp70的引物,利用ABI 7300PCR仪和SYBR Green,建立实时荧光PCR反应条件,通过比较Ct进行基因表达的相对定量分析。结果：熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳结果证明了PCR反应的特异性;相对定量结果显示,17AAG可以下调Akt及Raf基因的表达,上调Hsp90及Hsp70基因表达。结论：应用SYBR Green实时荧光PCR可以特异、准确地分析RPE细胞相关增殖基因表达差异,为系统研究17AAG治疗PVR的复杂调控机制创造有力条件。
【关键词】 SYBR Green;实时荧光PCR;17AAG;视网膜色素上皮;增生性玻璃体视网膜病变；热休克蛋白90
Detecting the expression of genes in human retinal pigment epithelium cells treated by 17AAG with SYBR Green realtime PCR
ZhiYang Xu, JiaQi Yao, QingHuai Liu,JianMin Li
1 Department of Cell Biology and Medical Genetics; 2 Medical Center, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China; 3 Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
Correspondence to: JianMin Li.Department of Cell Biology and Medical Genetics, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China. [email protected]
AbstractAIM: To establish a reliable SYBR Green realtime PCR method for detecting the effect of 17AAG on the expression of Akt, Raf, Hsp90, Hsp70 genes in human RPE cell.METHODS: RPE cells were cultured in vitro and incubated with 17AAG for 16, 24 and 48 hours, then collected for RNA extraction and reverse transcription. The primers were designed for Akt1, Raf1, Hsp90, and Hsp70 based on their gene sequence. After optimization of PCR parameter, realtime PCR was carried out on an ABI 7300 PCR Detection System with fluorescence dye SYBR Green. The relative quantification analysis was performed with comparative threshold cycle method.RESULTS: Melting curve analysis and agarose gel electrophoresis confirmed the specificity of the amplification products. Exposure to 17AAG could down regulated the expression of Akt and Raf (P< 0.05), but up regulated the expression of Hsp90 and Hsp70.CONCLUSION: The developed realtime PCR assay for detecting the expression of genes related to RPEproliferation with high specificity and good quality, is suitable to investigate the expression of genes and its regulation mechanism in development and diseases.
KEYWORDS: SYBR Green;realtime PCR;17AAG;RPE;PVR;Hsp90
0引言
增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)是孔源性视网膜脱离或视网膜脱离复位术后的主要并发症和手术失败的主要原因,严重影响视功能的恢复。其发病机制尚未完全明确,目前多数认为一些眼内细胞的去分化、增生和迁移在PVR的发生发展中起着重要作用，其中，视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞是起主导作用的细胞[1]。PVR的机制可能是眼内炎症诱发细胞过度增殖,其发生发展与炎症密切相关。寻找能同时抑制炎症和抑制RPE细胞增殖的药物可能是防治PVR的有效途径。目前的研究主要集中在抗肿瘤药物上，但多数因为毒性大或效果不佳而无法用于临床。17AAG（17丙烯胺基17去甲氧基格尔德霉素）作为一种新的Hsp90抑制剂，国内外许多文献报道其有很强的抗肿瘤作用，而且毒性较小[2]。最近已经进入临床II期实验。17AAG抑制肿瘤细胞增殖，也可以通过caspase途径导致细胞凋亡，或者抑制细胞周期相关蛋白,导致细胞周期阻滞等。其机制可能是抑制Hsp90的功能，导致Hsp90与效应蛋白的解离，而Hsp90的效应蛋白超过100种，其中很多是细胞内信号分子，如Akt1及Raf1[3]。而Akt1和Raf1是RPE细胞增殖信号通路的关键信号分子。这些信号分子在RPE细胞增殖过程中同样发挥重要作用[4]。已有研究表明，对于不同的细胞17AAG产生的效应存在区别[5]。我们观察17AAG对RPE细胞的抑制作用，并用定量PCR的方法检测17AAG对Akt1,Raf1,Hsp70和Hsp90的影响。从而探索17AAG用于治疗PVR的可能性。
1材料和方法
1.1材料
人视网膜色素上皮细胞株ARPE19（ATCC公司），培养基为DMEM/F12（Hyclone公司）和100mL/L胎牛血清（Gibco公司）。总RNA抽提试剂采用invitrogen公司的Trizol Reagent, Power Sybr Green PCR Master Mix为Applied Biosystems 公司产品。RPE细胞的培养和17AAG的刺激: 细胞培养使用人视网膜色素上皮细胞株ARPE19，培养基为DMEM/F12和100mL/L胎牛血清，加100mg/L青霉素和链霉素，置于37℃含有50mL/L CO2的饱和湿度培养箱中。根据Akt1、Raf1、Hsp90、Hsp70的mRNA基因序列, 用Primer Premier 5.0引物设计软件设计4对引物(表1)。表1 PCR引物及产物大小（略）
1.2方法
将17AAG(Sigma公司)溶于DMSO,等细胞处于对数生长期时加入17AAG，按给药浓度2,5,10μmol/L将细胞分为3组浓度梯度组，对照组加入等量DMSO，作用24h收集细胞。另按5μmol/L处理时间16，24，48h细胞分为3组时间梯度组,对照组加入DMSO。收集处理组和对照组的细胞(约1×107),分别加入1mL Trizol,按试剂说明书中的操作步骤进行RNA提取,加无RNA水，70℃保存。琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测抽提RNA的质量和浓度。用MMLV反转录酶将RNA反转录成cDNA,反应体系25μL包括RNA 2μg,反转录酶1μL, RNase抑制剂1μL,随机引物(0.5μg) 1μL, 5×buffer 5μL以及2mmol dNTP 6.25μL,37℃水浴1h合成的cDNA置20℃保存备用。应用ABI 7300荧光PCR仪和配套的美国应用生物技术公司的Power Sybr Green PCR Master Mix进行RTPCR。反应体系20uL中包括: cDNA 2 μL, 2×Power Sybr Green PCR Master Mix 10μL, 上下游引物各 5pmol。反应在专用的96孔板上进行, 用专用的透明膜覆盖于板上,使反应体系密闭于反应孔中, 设置PCR 反应程序: 50℃ 2min 激活UNG酶去除残余的产物污染, 95℃ 10min 激活Taq Gold酶,开始扩增, 95℃ 15s 变性, 60℃ 1min 退火及延伸,重复40个循环。在60℃ 1min收集荧光信号，循环结束后执行熔解曲线程序。为进一步确定扩增产物的特异性,反应结束后每个反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
统计学处理:实时PCR的结果以Ct值表示。相对定量采用比较Ct法,根据等式Fold=2△△Ct来计算处理组和对照组之间目的基因的相对表达差异,△△Ct值表示处理组和对照组间的△Ct值差异,计算结果以两组间目的基因拷贝数的比值,即Fold值来表示。17AAG处理组和对照组间的目的基因比较采用REST2005统计软件进行处理和分析。
[1] [2] 下一页 |
