作者：于长江，段穆，洪晶
作者单位：1(117000)中国辽宁省本溪市本钢总院眼科；2(100024)中国北京市,北京大学医学部第三附属医院眼科中心
【摘要】目的:研究热烧伤后人角膜组织中的基质金属蛋白酶2、9(MMP2、MMP9)的表达与分布，探讨其含量的变化与角膜病变的相关性。方法:收集铁水烫伤后行角膜移植患者病变角膜19例,正常角膜组织10例。应用免疫组化染色方法检测MMP2、MMP9在角膜各层次中的分布与表达，应用图像分析系统进行半定量分析。结果:MMP2、MMP9在正常角膜组织中均未见阳性表达，平均灰度值分别为117.8188±3.7967，119.1902±0.9679。热烧伤后角膜组织中，MMP2的阳性表达主要分布于角膜基质层，平均灰度值为94.4197±5.8327；MMP9的阳性表达主要分布于角膜上皮层和基底膜附近，平均灰度值为115.0188±0.7149。将正常角膜组织中和病变角膜组织中两种酶的平均灰度值分别进行统计学分析，P值均<0.05。随着病程的发展，在病变角膜组织中MMP2的阳性表达先呈现逐渐增高趋势14d后逐渐下降，角膜基质层溶解达高峰时阳性表达的量最高；MMP9在患病初期角膜基底膜病变明显时表达较高，后期逐渐下降。结论:MMP2、MMP9对热烧伤后的人角膜组织病变的发展起重要的作用。MMP2主要参与角膜基质层的损害，MMP9主要参与角膜上皮层和基底膜的损害。
【关键词】 基质金属蛋白酶;角膜;热烧伤
Expression of MMP2 and MMP9 in corneal thermal burn
ChangJiang Yu, Mu Duan， Jing Hong
Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 30670816)
1 Department of Ophthalmology, General Hospital of Benxi Steel, Benxi 117000, Liaoning Province, China; 2 Ophthalmic Center, the Third Affiliated Hospital, Peking University Health Science Center, Beijing 100024, China
Correspondence to: ChangJiang Yu. Department of Ophthalmology, General Hospital of Benxi Steel, Benxi 117000, Liaoning Province, China. [email protected]
AbstractAIM: To study the expression and distribution of the matrix metalloproteinase2 and 9 (MMP2, MMP9) in corneal thermal burn, and to evaluate the correlation between the content of MMP2, MMP9 and the cornea pathological change.
METHODS: Nineteen cases with thermal burn's corneas and 10 samples with normal person's corneas were collected.The expression and distribution of MMP2 and MMP9 in corneas were tested in immunohistochemical dying. The experimental results were analyzed by computer analysis system.RESULTS: The expression of MMP2 and MMP9 were not seen in the normal cornea. The average gray value was 117.8188±3.7967 and 119.1902±0.9679. The expression of MMP2 and MMP9 were found in the corneal thermal burn. MMP2 mainly located in corneal stroma with average gray value of 94.4197±5.8327. MMP9 located in corneal epithelium and basement membrane with average gray value of 115.0188±0.7149. The expression of MMP2 and MMP9 had statistical significance in the course of the corneal thermal burn (P<0.05). MMP2 increased gradually at first and then drop after 14 days. MMP9 expressed relatively high in initial stage and drop gradually on later stage.CONCLUSION: MMP2 and MMP9 may play an important role in the course of the corneal thermal burn. MMP2 participates in the harm in corneal stroma mainly. MMP9 participates in the harm in corneal epithelium and basement membrane.
KEYWORDS: matrix metalloproteinases; corneal; thermal burn
0引言
角膜热烧伤是一种严重的致盲性角膜疾病，其病变特点角膜基质溶解坏死，角膜透明度下降，重者角膜穿孔、眼内炎症致视力丧失；其病理基础是角膜胶原纤维和蛋白聚糖降解。目前，临床对此疾病缺乏有效的治疗手段，因此对这种疾病发病机制的研究十分必要。在热烧伤后的角膜组织中虽然伴有多种酶变，但基质金属蛋白酶（MMPs）在这种疾病的发生和发展过程中可能起着主要的作用。目前，相关的研究虽然取得了较大的进展，但现有研究多局限在动物；本次实验利用收集到的热烧伤后的人角膜组织标本，观察角膜热烧伤性疾病中MMP2、MMP9的表达，明确它们在角膜热性烧伤不同病程中含量的变化，研究热烧伤角膜组织中MMPs和角膜溶解的关系，为将来临床合理的应用基质金属蛋白酶抑制剂来治疗角膜热烧伤患者提供必要的理论依据。
1材料和方法
1.1材料
本实验收集角膜组织标本时间为200109/200311。19个符合Ealing诊断标准Ⅲ～Ⅳ级重度角膜热烧伤患者的病变角膜（由中国医科大学第一附属医院眼科提供，均为穿透角膜移植所得到的标本），平均年龄36岁，均为男性，标记为B组。阴性对照组：10个均为意外死亡用于角膜移植后残留的正常人角膜，既往无角膜移植禁忌证病史，平均年龄33岁标记为A组。试剂及器材：SP超敏免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒，即用型鼠抗人MMP2、MMP9单克隆抗体（以上试剂盒及抗体为福建迈新生物技术开发公司产品），以上两种单克隆抗体作为一抗。生物素标记的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG（二抗），辣根酶标记链酶卵白素，二甲基亚砜防冻液，显微镜数码照相机系统，MetaMorph/DP10/BX41计算机图像分析系统(UIC/OLYMPUS,US/JP生产),深低温冰箱,水浴箱等。
1.2方法
1.2.1角膜的保存及复温
将收集到的角膜分别放入装有2.5mL的50g/L,75g/L二甲基亚砜抗冻剂的小瓶中，4℃下冷平衡各30min；20℃保存1h后，放入深低温冰箱（80℃）编号保存角膜。角膜的复温，放入40℃恒温水浴箱中5min。
1.2.2免疫组化染色及检测
复温后的角模标本分组常规固定、脱水后，浸蜡包埋，5μm连续切片。石蜡切片常规脱蜡至水。30mL/L过氧化氢孵育10min。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min。滴加封闭用正常山羊血清工作液室温孵育15min，倾去。滴加一抗，4℃过夜。PBS冲洗，3min×3次。滴加生物素化二抗工作液(通用型生物素标记羊抗兔、鼠IgG)，室温孵育60min。PBS冲洗，3min×3次。滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，室温孵育60min。PBS冲洗，3min×3次。DAB显色剂显色。自来水充分冲洗，复染，封片。光学显微镜观察基质金属蛋白酶2、9在角膜内的表达。显微镜数码照相机系统对染色后的切片拍照，免疫组化计算机图像分析系统分析角膜切片，对收集的数据进行统计学分析。
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