作者：闫涛
作者单位：（430022）中国湖北省武汉市，华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科
【摘要】 目的：研究再生丝素膜作为组织工程角膜支架材料的可行性。
方法：制备再生丝素膜，测定其接触角与透光率；在材料上接种兔角膜上皮细胞，观察细胞生长情况，MTT法测定6h贴壁率；将膜材料植入兔角膜基质层间，观察材料的透明性、可降解性及生物反应性。
结果：再生丝素膜材料接触角为58.2度；492nm波长透光率为93.0%，570nm波长透光率为94.4%；细胞在材料表面贴附良好，6h贴壁率为31.6%，经统计学比较优于普通培养板；4wk时材料开始变得不透明，从角膜缘长入新生血管，8wk时新生血管达到高峰，12wk时材料部分降解，至16wk材料大部分降解，新生血管显著减少。
结论：再生丝素膜具有较好的生物相容性。
【关键词】 丝素 组织工程 角膜 支架材料 生物相容性
0引言
组织工程学是应用生命科学与工程科学的原理和方法，在体外预先构建一个有生命的种植体，用于修复器官缺损，替代器官的一部分或全部功能[1]。由于角膜移植供体的严重缺乏，人工角膜的局限性，生物材料学、细胞生物学、分子生物学及临床医学的不断发展，为组织工程角膜的构建开辟了新的道路。家蚕蚕丝中的丝素蛋白成分是一种天然的高分子聚合物，作为手术缝线用于临床已有100多年的历史。近年来，由于其低免疫原性、良好的生物相容性及特有的理化性质，丝素蛋白作为一种新的生物材料应用越来越受到关注。通过多种方法改进、表面修饰等技术控制丝素蛋白的分子结构和形态，使得丝素蛋白在生物材料和组织工程领域的应用变得更为广泛。我们利用丝素蛋白在适当的条件下，合成透明的膜状材料，观察其相关表征及生物反应性，研究其作为一种新的组织工程角膜支架材料的可行性。
1材料和方法
1.1材料 去蛹蚕茧（浙江杭州）；DMEM/F12=1∶1混合液（美国Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；胰蛋白酶（美国Sigma公司）；MTT（美国Sigma公司）；新西兰大白兔（同济医学院实验动物中心）；Sunrise酶标仪（瑞士Tecan公司）；OCA20型接触角测量仪（德国Dataphysics公司）；其余试剂均为国产分析纯。去蛹蚕茧在5g/L的Na2CO3溶液中煮沸45min，共2次，以去除生丝表面的丝胶蛋白。经清洗干燥后，将丝素蛋白溶解于适量的氯化钙、水和乙醇混合溶液中（摩尔比为1∶8∶2），所得溶液在流水中透析3d以除去氯化钙和乙醇，制得丝素蛋白的水溶液。将丝素蛋白水溶液在45～50℃温和搅拌浓缩至120～160g/L后，倾倒在聚苯乙烯培养皿中成膜，在60℃下真空干燥，得到不溶于水的丝素薄膜[2]。
1.2方法
1.2.1接触角测定 在28℃,湿度65%的条件下,去离子水作为测试液体,将所制得的膜材料固定在OCA20型接触角测量仪上,测定其接触角。共测试6次，取其平均值θ。
1.2.2透光率测定 将复水后的丝素膜置于96孔培养版，使之紧贴培养板底部，加入适量去离子水后，酶标仪分别测定492nm，570nm测定吸光度值（A），根据以下公式计算其透光率：T=1/10A×100%。不同波长下均各检测8个孔，分别计算后取平均值。
1.2.3细胞贴壁率 按照文献[3]所述方法作兔角膜上皮细胞原代培养，经2次传代后，取对数期生长的细胞接种于贴有再生丝素薄膜的24孔培养板，对照组接种于普通培养板，各10孔。在37℃、50mL/L CO2及饱和湿度条件下的培养箱中培养6h后，观察细胞形态及贴附情况，并采用MTT法测定细胞悬液吸光度值An。通过实验已利用MTT法测得当细胞悬液的密度为M0=1.0×108/L时，在492nm处的吸光度值为A0=0.137。根据一定范围内活细胞数与吸光度值成正比，可以计算出6h后贴壁存活细胞数，并据此算得6h细胞贴壁率：pn =An/A0×100%（n=1,2,…,10）
1.2.4体内埋植试验 厚度为0.3mm的膜材料，于紫外灯下照射消毒30min后，浸泡于庆大霉素浓度为0.5g/L的生理盐水中，备用。选取8周龄健康新西兰大白兔16只，质量约2.5kg，随机分为实验组和对照组各8只。采用氯胺酮（50mg/kg）和异丙嗪（25mg/kg）等体积混合im麻醉，5g/L丁卡因点眼局部麻醉。按照无菌显微操作的步骤，实验组右眼角膜缘内侧1.5mm处行板层切开，深约0.15mm。用虹膜恢复器伸入作基质层钝性分离，形成约6mm×6mm板层囊袋，植入直径5mm材料于囊袋内，100尼龙线缝合切口3针。对照组右眼同法仅作囊袋，不植入材料。术后氯霉素眼水点眼3次/d，四环素眼膏涂眼1次/晚。术后1wk每日肉眼观察有无炎症反应；裂隙灯观察局部有无充血、角膜水肿、新生血管形成，2～3次/wk。注意观察材料的吸收降解以及与周围组织融合的情况；术后16wk取角膜标本作石蜡包埋，HE染色切片。
统计学处理：采用SPSS 12.0，t检验。
2结果
2.1材料的制备与表征 我们所制备的再生丝素薄膜，在干燥状态下为透明薄膜，质脆，易开裂；经复水后薄膜稍膨胀，柔软，脆性消失而韧性增加，不易开裂，厚度控制在约0.3mm。干燥状态下，该膜状材料的接触角为58.2度。复水后测定，在492nm及570nm处的透光率分别为93.0%和94.4%。
2.2材料的生物相容性评价 将密度为M0=1.0×108/L的细胞悬液分别接种于贴有再生丝素薄膜的24孔培养板及作为对照的普通培养板，6h后置于镜下观察细胞形态并分别计算贴壁率（31.6%±5.0% vs 11.8%±1.8%，P<0.01，图1）。体内埋植实验组1wk内术眼出现结膜充血、角膜水肿，1wk后逐渐水肿消失、充血消退；4wk时新生血管自角膜缘切口向材料生长并覆盖材料，材料透明度降低，余角膜范围仍保持透明；8wk时可见材料变得不透明，覆盖于材料植入区域的新生血管密度增加，并环绕于材料周围；12wk时可见植入材料自边缘开始降解，可见数根较粗大新生血管；材料植入16wk后，大部分已降解，仅中央可见部分已崩解之不透明区域，新生血管显著减少（图2A）。对照组2wk时角膜切口已基本愈合，全角膜透明，无水肿及结膜充血。HE染色切片，可见材料大部分降解吸收，可见部分碎片；新生胶原及角膜基质细胞长入并包绕剩余材料；同时可见新生血管管腔（图2B）。
图1 埋植材料贴附情况：细胞贴附于材料，呈圆形（略）
图2 材料植入术后变化情况（略）
A：植入16wk后大部分降解，中央可见部分崩解不透明区域，新生血管显著减少；B：对照组2wk全角膜透明，无水肿及结膜充血HE染色×40
可见，材料大部分降解吸收可见部分材料碎片(→及↗),并由新生胶原包绕，可见新生血管管腔()
3讨论
组织工程学自20世纪80年代兴起以来，迅速成为材料学及生物医学领域的热点。在利用组织工程学原理构建角膜的研究中，Minami等[4]首次应用胶原凝胶和气液交界面培养技术将角膜3种细胞共同培养而建立三维牛角膜重建模型[5]。Griffith等[6]用转基因技术建立角膜各层永生化细胞系构建人工生物角膜,其组织结构、内皮细胞泵的功能与正常人生理角膜相似。目前，组织工程学的研究热点主要集中在3个方面：种子细胞、支架材料和细胞外基质。其中，成功的关键是选择合适的支架材料来使种子细胞生长增殖,形成近似体内的正常结构。研究证明，丝素蛋白可以多种形式(如薄膜、网状结构、海绵状等)在体外支持干细胞的黏附、增殖和分化，体内促进组织的修复[7]。再生丝素膜通常易溶于水，且机械性能较差。以往通用的办法是采用化学交联如甲醇来改善这一情况。我们不经化学交联，而是通过调节干燥条件，直接制备再生丝素膜，从而避免了化学物质可能对生物机体产生的不良影响，降低生物相容性。接触角的大小取决于材料的表面能和液滴本身的表面张力，是用来表征材料表面的湿润性、清洁程度和亲疏水性的一个物理量。材料表面的亲疏水性对于细胞在材料表面的黏附有很大影响，实验数据表明再生丝素膜有较好的亲水性。透明是组织工程角膜构建中的一个必然要求，是选择角膜支架材料的基本条件之一。以往研究中所选择的支架，包括生物活性材料（如胶原、壳聚糖、脱细胞基质）及人工合成材料（如PLA,PGA,PMMA等）皆为透明材料。再生丝素膜对不同波长光的透过率均非常高，证明该材料具有良好的透明度，符合组织工程角膜构建的这一基本条件。
我们从体内植入和体外细胞培养两方面来评价再生丝素膜的生物相容性。贴壁率反映了细胞与其生长基质的接触行为和生长基质的生物相容性。本实验中细胞培养显示，再生丝素薄膜较普通培养板能更好的诱导细胞的贴壁，贴壁细胞形态均匀[8]。材料的体内埋植试验显示，16wk后材料大部分降解，除残留中央约直径2mm范围未降解部分外，余角膜组织均完全透明。观察过程中未见感染、材料被排出或其他明显炎症反应的表现，新生血管在植入后8～12wk达到生长高峰，之后随材料的降解吸收而逐渐消退，至16wk时新生血管已显著减少。降解过程中材料逐渐变得不透明，考虑可能为降解中间产物及其沉积所致，随着材料的进一步降解及降解产物的吸收，植入区逐渐恢复成透明角膜组织。组织切片亦显示植入16wk后，随材料的大部分降解，新生的胶原组织及角膜基质细胞长入其间，未见明显炎性细胞浸润。本实验结果表明，以丝素蛋白为原料合成的膜状材料生物相容性好，无明显毒性及免疫原性，可以体内降解，适合细胞生长，可能成为组织工程角膜支架材料的一个新选择。
【参考文献】
1 Langer R, Vacanti JP. Tissue engineering. Science 1993;260:920926
2吕强,曹传宝,张瑛,等.新方法制备不溶性丝素薄膜及其性质研究.高等学校化学学报2004;25(9):17521755
3沈玺,叶纹,钟一声.羊膜对兔角膜上皮细胞影响的实验研究.眼科2000;9(5):300302
4 Minani Y, Svginala H, Oono S. Reconstruction of cornea in threedimensional collagen gel matrix culture. Invest Ophthalmol Vis Sci1993;34(7):23162324
5张超,胡丹,金岩.组织工程角膜治疗免无菌性角膜溃疡.国际眼科杂志2006;6(6):13231325
6 Griffith M, Osborne R, Munger R. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science 1999;286(2447):21692172
7 Wang Y, Kim HJ, VunjakNovakovic G, et al. Stem cellbased tissue engineering with silk biomaterials. Biomaterials 2006;27(36):60646082
8张超,胡丹,金岩.体外构建含细胞组织工程角膜基质的方法.国际眼科杂志2007;7(1):9091 |
