作者：崔志利
作者单位：（710032）中国陕西省西安市，第四军医大学西京医院眼科；（710054）中国陕西省西安市，解放军第451医院眼科
【摘要】目的：进一步研究苏拉明(suramin)对体外培养的人视网膜色素上皮细胞（RPE）移行和增殖的抑制作用。
方法：（1）在RPE损伤愈合模型中观察150mg/L suramin对RPE移行的抑制作用。（2）采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）测定体外培养的人RPE在150mg/L suramin作用下的增殖活性的抑制。
结果：（1）移行实验发现：150mg/L的suramin在24h对RPE的移行抑制率为48%；（2）增殖实验发现，150mg/L的suramin在3d时对RPE的增殖抑制率为51%。
结论：suramin可以显著抑制细胞的移行和增殖，对细胞移行能力的抑制发生在抑制增殖作用之前，提示苏拉明对RPE的抑制可能是先抑制细胞的移行，尔后抑制细胞的增殖，为苏拉明的临床应用提供进一步相关依据。
【关键词】 视网膜色素上皮细胞 眼 移行
0前言
视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)的移行是增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy，PVR）以及视网膜下新生血管等疾病发生的重要环节，而RPE的迁移被认为是PVR发病的起始阶段[1]，在这些疾病中RPE在它们原位活化后，开始从其正常静止的位置移行至视网膜表面和玻璃体中，在获得重新的附着后开始增殖。目前对这类疾病主要采取手术治疗，我们试图寻找到阻止或抑制RPE的移行和增殖活性的有效辅助药物，在以前的试验中我们发现苏拉明对RPE的移行和增殖均有明显的抑制作用，我们将之进行了进一步的对照研究。
1材料和方法
1.1材料 由4个不同人来源的第3代RPE作为实验细胞（由第四军医大学西京医院全军眼科研究所王雨生教授惠赠），苏拉明（suramin）（ALEXIS,Comerstone, San Diego,USA ）、。Delbecco改良的Eagle培养基（Delbeccon′s modified Eagle′s medium,DMEM）干粉（Gibco产品）、胰蛋白酶（Difco产品）、新生小牛血清（四季青产品）、苏拉明（suramin）（ALEXIS,Comerstone, San Diego,USA ）、四甲基偶氮唑盐（美国Sigema公司产品）、二甲基亚砜（DMSO,上海化学制品厂）、细胞培养板（NUNC,Denmark）。
1.2方法
1.2.1细胞培养及分组 复苏RPE，用含50mL/L血清的DMEM培养液稀释，37℃，50mL/L CO2孵箱静置培养，次日换液。细胞接近铺满时传代,选4～7代细胞用于实验。移行实验分移行对照组和移行抑制组，增殖实验分增殖对照组和增殖抑制组。对照组均为含100mL/L血清的DMEM，抑制组为含有suramin（150mg/L）的100mL/L血清的DMEM。
1.2.2移行实验 实验分空白对照组，对照组，实验组3组。将RPE以5×104个/每孔种植在24孔细胞培养板上，当细胞呈生长融合状态2d后，加入含有10mg/L丝裂霉素C（Sigma, St. Louis, MO）的DMEM，以抑制细胞增殖[1]。培养2h后用5mm宽的剃须刀片在培养板中刮出一片无细胞区。用DHanks液轻冲洗3遍，将脱落漂浮的细胞冲洗干净后，对照组加入含100mL/L新生小牛血清的DMEM，实验组加入含suramin（150mg/L）的100mL/L血清的DMEM，1mL/孔。细胞经上述处理后，继续在37℃，50mL/L CO2孵箱中孵育培养，于处理后24h，每组每种浓度取三孔细胞，用0.01mol/L的PBS冲洗3次，40mg/L多聚甲醛溶液固定30min，HE染色，在显微镜下每孔选择3个视野（×100），计数移入刮痕区内的细胞数。实验重复3次。
1.2.3 增殖实验 采用MTT比色法，2.5mg/L胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液，接种于96孔板，约5×103个细胞/孔，体积200μL/孔。培养12h后换液，每组设4个副孔。第3d时，加入5000mg/L的 MTT溶液20(L/孔，继续孵育4h，中止培养。加入二甲基亚砜（DMSO）150μL/孔，振荡10min，使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪490nm波长下读取A值(absorbance values)。重复实验3次。
统计学处理：实验数据用±s表示，采用t检验检测各组之间的差别。
2结果
2.1移行实验 观察期内，镜下未发现RPE形态的异常变化，未见细胞分裂像,移行细胞胞体伸展，拉长。在24h时移行对照组移行细胞数为141±13.5个，含150mg/L的suramin的移行抑制组移行细胞数为73.3±8.0个，移行抑制率达到48％(P<0.01）。
2.2增殖实验 经MTT比色法测试，第3d时增殖对照组A值为0.247±0.17，含150mg/L的suramin的增殖抑制组A值为0.126±0.09，增殖抑制率达到51％(P<0.01）。
3讨论
在正常生理状态下RPE在其原位时处于静止状态，并不增生，在视网膜脱离、外伤或手术等因素刺激导致血眼屏障破坏时，从视网膜裂孔处进入玻璃体的RPE，在多种作用刺激下，发挥其趋化、增殖、产生胶原、牵拉收缩等能力，最终导致牵拉性视网膜脱离。RPE进入细胞周期并开始增生，主要包括以下一系列的改变[2]：（1）RPE的迁移：RPE在正常位置时与Bruch’s膜存在紧密联结，在某些病理条件下，如视网膜裂孔形成，使其从Bruch’s膜上脱离下来。在孔源性视网膜脱离眼的玻璃体和视网膜下液中可检测出RPE和巨噬细胞样细胞，有伪足样运动，说明其出现了迁移行为。这时RPE可能会改变表面受体结构或自身合成某种成份，从而变得对某些趋化因素敏感，产生移行活动。（2）RPE形态功能的变化：在离开原位后，因周围微环境的变化，RPE开始失去原有的分化形态特点，在形态和功能上发生很大改变，在玻璃体液态环境中具有巨噬细胞样的伪足，可作近距离的移行，并对某些趋化因素变得敏感；当移行到玻璃体网织状纤维或视网膜表面时，RPE呈成纤维细胞样细胞，开始增生，并合成胞外基质。部分RPE甚至表现出肌成纤维细胞样特征，具有特殊的微丝微管结构，有自身收缩功能，并能够介导胶原等胞外基质的收缩。（3）自分泌增生循环：RPE一旦进入玻璃体腔中或视网膜表面，将会发生自分泌反应，成为各种因子产生的重要源泉。在这个变化过程中RPE可以表达多种蛋白及合成多种生长因子，在视网膜前膜中或RPE培养液中，可检测出胰岛素样生长因子（IGF）、碱性成纤维细胞生长因子（FGF）、上皮细胞生长因子（EGF）、血小板源性生长因子(PDGF)和转化生长因子（TGF）等[3]。这些生长因子又可以趋化RPE和视网膜胶质细胞[4],并刺激其增殖，最终形成具有收缩性功能的视网膜前膜或视网膜下膜，发生瘢痕样改变，导致PVR形成。
Suramin是肝素类似物，与肝素结合蛋白结合，体外实验发现它可竞争性的与细胞因子本身，其配体或其细胞表面受体结合，干扰细胞因子的活性效应，阻止多种细胞因子刺激肿瘤细胞的增殖[5]。我们以往的实验发现suramin可以抑制RPE的移行和增殖活性[6，7]，在本次的对照研究中发现同样剂量浓度的suramin在24h时对RPE移行的抑制将近50%，而在第3d时对细胞的增殖抑制达到50%，其对RPE的抑制是先抑制移行，再抑制增殖，这一结果提示我们，suramin可能会通过抑制RPE早期的移行，而阻断RPE进入细胞周期并开始增生的活性，为其成为临床防治增生性玻璃体视网膜病变的一种安全有效的新药提供进一步的研究依据。
【参考文献】
1 Leschey KH, Hines J, Singer JH, et al. Inhibition of growth factor effects in retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 1991;32(6):17701778
2 Hiscott P, Sheridan C, Magee RM, et al. Matrix and the retinal pigment epithelium in proliferative retinal disease. Prog Retin Eye Res 1999;18:167190
3 Campochiaro PA. Pathogenic mechanisms in proliferative vitreoretinopathy. Arch Ophthalmol 1997;115:237241
4 Campochiaro PA, Hackett SF, Vinores SA. Growth factors in the retina and retinal pigmented epithelium. Prog Ret Eye Res 1996;15:547567
5 Stein CA Suramin: a novel antineoplastic agent with multiple potential mechanisms of action. Cancer Res 1993;53(10 Suppl):22392248
6康军，惠延年，崔志利.苏拉明对体外培养的视网膜色素上皮细胞移行的影响.山西医科大学学报2001；32（2）：117119
7康军，崔志利，海鸥,等.细胞因子及苏拉明对视网膜色素上皮细胞增殖的影响.国际眼科杂志2005； 5（4）：655658 |
