作者:刘玉福
作者单位:(100005)中国北京市,首都医科大学附属北京同仁医院;(100730)中国北京市眼科研究所
【摘要】目的:为研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)及其受体抗体对人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells, HLECs)超微结构的影响。
方法:采用透射电镜观察正常HLECs及bFGF作用后及受体抗体阻断bFGF在HLECs作用的超微结构变化。
结果:正常HLECs胞内较多的线粒体、粗面内质网和游离核糖体及少量微丝结构,核膜完整,染色质均匀。bFGF作用后表现为细胞膜完整,膜局部突起较多,线粒体和游离核糖体明显增多,基质较致密,细胞核附近有较多微丝结构,核膜完整,染色质均匀,核仁增大。bFGF受体抗体阻断作用后表现为细胞突起消失、细胞膜明显破坏,大量线粒体空化,嵴消失,基质减少,呈云雾状退化,内质网明显减少至消失,核膜破坏明显,有的细胞结构不清,趋于死亡。
结论:bFGF对HLECs的促增殖作用可被FGF受体抗体所阻断。
【关键词】 人晶状体上皮细胞 碱性成纤维细胞生长因子 受体 抗体 电镜
0引言 后囊混浊的发生与术后晶状体上皮细胞增殖、迁移及纤维化有关,在晶状体后囊变化与生长因子的作用密切相关,尤其是碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)受体的作用更不容忽视。阻断FGF受体可抑制bFGF对HLECs增殖作用[1],我们对其作用使细胞超微结构发生变化进行研究。
1材料和方法
1.1胎儿晶状体上皮细胞培养 同一个胎儿新鲜的2个眼球,生理盐水充分冲洗干净,再用庆大霉素冲洗,置干净的玻璃器中,清除眼球周围组织,剪去结膜。用已稀释的庆大霉素溶液充分冲洗已处理的眼球,置另一干净的玻璃培养器中,在超净工作台上距角膜缘约4cm处环形剪开巩膜,移去上部(角膜用作培养角膜上皮细胞)后取出晶状体。沿晶状体赤道部分离出前囊膜,放入27mm直径的塑料培养皿,细胞面朝皿底,加几滴合150g/L DMEM培养液(pH 7.2),用虹膜剪子将囊膜尽量剪成碎块,展平并分散开后放入CO2箱(日本SANTO公司MCO17AI)中约4h,然后,轻轻地补加培养液约2.5mL,继续培养(培养条件为37℃,50mL/L CO2,饱和温度。每日显微镜下观察细胞生长情况,7~10d更换培养液。
图1 A:胞内较多的线粒体,粗面内质网,游离核糖体及少量微丝结构;核膜完整,染色质均匀(×17000);B:胞内较多的线粒体、丰富游离核糖体及少量微丝结构(×22000)(略)
传代培养:当细胞生长融合时,吸出培养液,用Hanks液冲洗2次,加2.5g/L胰蛋白酶溶液1.5mL,消化4~8min吸出,加入含150g/L FCF DMEM培养液反复吹打,使细胞悬浮,公布均匀,然后分至几个培养皿继续培养。
1.2细胞标本的制备 使用2代细胞进行实验。将切成小块的盖玻片消毒后放在27mm直径的玻璃培养器内,将胎儿晶状体上皮细胞、加入bFGF(100μg/L)细胞及加入bFGF(100μg/L)和bFGF受体抗体(5mg/L)的细胞悬液分别滴在培养器内的盖玻片小块上,制成3个不同样本,放入CO2培养箱内4d。
1.3透射电镜标本制作 待盖玻片长满细胞,弃去培养液,用Hanks液冲洗2次。用橡皮刮刀将贴壁生长的细胞刮下,离心后去除上清,30g/L戌二醛固定后,加入10g/L锇酸固定,乙醇逐级脱水,Epon812渗透包埋,60℃温箱内聚合72h,LKBB400型超薄切片机切片,醋酸铀和枸酸铅双染,于philips EM 400T透射电镜下观察并照像。
2结果
2.1胎儿晶状体上皮细胞 胎儿晶状体上皮细胞(2代)表现胞内正常的线粒体、粗面内质网、游离核糖体及少许微丝结构;核膜完整,染色质均匀,细胞器数目有限,提示了HLECs功能尚可,但其有增殖能力差的特点(图A,B)。
2.2加入bFGF(100μg/L)的胎儿晶状体上皮细胞 在胎儿晶状体上皮细胞培养中加入bFGF,其细胞超微结构为:细胞膜完整,局部突起较多,呈短棒或指状;胞内较丰富的细胞器,尤其可见功能良好的线粒体明显增多,基质亦较致密,并见游离核糖体增多,近核附近有较多沿细胞长轴平行排列的微丝结构;核膜完整,染色质粗大、均匀,核仁增大。细胞器增多,说明了加入bFGF后,其对细胞发挥了促增殖作用,使细胞的代谢功能旺盛,有丝分裂能力增强;同时说明了bFGF对此细胞亦有一定的分化效应,如超微结构见到沿长轴排列的微丝结构,是细胞分化后典型的特征(图2,3)。
2.3加入bFGF(100μg/L)和FGF受体抗体(5mg/L)胎儿晶状体上皮细胞 同时加入bFGF和FGF受体抗体时,细胞超微结构表现为细胞突起消失,膜明显破坏,大量线粒体空化,嵴消失,基质减少,呈云雾状退化,内质网亦明显减少甚至消失,仅有少量微丝并呈断裂状,细胞器明显减少、破坏,有的消失;核膜破坏明显;有的细胞结构不清甚至趋于死亡,提示了抗体中和实验bFGF受体被其抗体所拮抗,使bFGF的作用消失,细胞代谢基本消失,并趋向死亡状态(图4,5)。
图2 胎儿晶状体上皮细胞(2代)+bFGF近细胞核附近有较多沿细胞长轴平行排列的微丝结构;核膜完整,染色质均匀,核仁增大(×36000)(略)
图3 胎儿晶状体上皮细胞(2代) +bFGF细胞包膜完整,局部突起较多,呈短棒或指状;胞内细胞器丰富,较多的线粒体,基质较致密,游离核糖体增多(×4600)(略)
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