作者：武海军
作者单位：（510282）中国广东省广州市，南方医科大学珠江医院眼科
【摘要】 目的：研究基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase9，MMP9）在人正常角膜及真菌性角膜溃疡中的基因表达，探讨MMP9在真菌性角膜溃疡形成中的作用。
方法：搜集24份真菌性角膜溃疡标本（溃疡组）及12份人正常角膜组织标本（对照组），其中12份真菌性角膜溃疡组织和6份正常的角膜组织分别抽提组织总的RNA，以Primer 5.0软件设计MMP9的特异引物，并对标本RNA进行RTPCR扩增，以MMP9目的电泳条带与βactin内参照条带灰度值比值代表相对表达量。分12份角膜溃疡组织和6份正常的角膜组织进行免疫组化检测MMP9表达，通过免疫组化染色的灰度值进行统计学分析。
结果：MMP9在真菌性角膜溃疡中的表达明显高于正常角膜，且主要位于角膜上皮层、基底膜以及基质层。
结论：真菌性角膜溃疡组织中MMP9的基因表达明显上调。MMP9在真菌性角膜溃疡的发生、发展及角膜穿孔中起着重要作用。加强MMP9在真菌性角膜溃疡中的作用机制的研究，有望对真菌性角膜溃疡的治疗提供新的途径。
【关键词】 真菌性角膜溃疡 基质金属蛋白酶 逆转录聚合酶链反应
0引言
真菌性角膜溃疡首先于1878年由Leber报道。是一种由真菌引起的化脓性感染性角膜病变,对眼组织的破坏和视力的影响极为严重，其致盲率很高。特别是近几年来由于抗生素及激素的滥用及诊断水平的不断提高，真菌性角膜溃疡的发病有明显的上升趋势[1]。基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase9，MMP9）亦称明胶酶B，是眼组织中研究的较为广泛的基质金属蛋白酶家族成员之一，这可能是因为其优先降解基底膜成分，如IV型胶原。因此本研究采用免疫组化和RTPCR方法半定量分析研究了MMP9在正常人角膜组织及真菌性角膜溃疡组织中的基因表达，探讨基质金属蛋白酶9在真菌性角膜溃疡形成机制中的作用，以期为真菌性角膜溃疡新的治疗途径提供理论依据。
1材料和方法
1.1材料 标本收集24份真菌性角膜溃疡组织（溃疡组），经临床霉菌培养均为镰刀菌感染[2]经药物治疗效果不佳，濒临穿孔或前房积脓严重者，行穿透性角膜移植术后切除的病变组织。保存于液氮中备用。12份因外伤摘除眼球的正常角膜组织作为对照组。将新鲜的标本组织，保存于液氮中备用。
1.2方法
1.2.1免疫组化 取12份真菌性角膜溃疡组织和6份正常的角膜组织标本分组常规固定、脱水后,浸蜡包埋, 5μm连续切片,常规脱蜡至水。30mL/L过氧化氢孵育10min,冲洗, PBS浸泡5min。滴加正常山羊血清工作液室温孵育15min,倾去。滴加一抗, 4℃过夜,冲洗, 3min×3次。滴加生物素化二抗,室温孵育60min,冲洗, 3min×3次。滴加辣根酶标记链酶卵白素,室温孵育60min,冲洗, 3min×3次。DAB显色剂显色。自来水充分冲洗,复染,封片。观察MMP9在角膜内的表达。免疫组化计算机图像分析系统分析角膜切片,对收集的数据进行统计学分析。
1.2.2 RTPCR法检测MMP9 mRNA的表达 RTPCR(reverse transcription—polymerase chain reaction)引物应用primer 5.0程序设计，并由上海博亚生物技术有限公司合成。MMP9引物上游引物5’ACCTTCACTCGCGTGTACAGC 3’下游引物5’GCGGAGTAGGATTGGCCTTG 3’，扩增长度为439bp；βactin内参照上游引物5’TGCACCACCAACTGCTTAGC 3’，下游引物为5’AGCTCAGGGATGACCTTGCC 3’，扩增长度为217bp。参照TRIZOL试剂说明书对12份真菌性角膜溃疡组织和6份正常的角膜组织分别提取总RNA,紫外分光光度仪检测浓度和纯度,取2μg总RNA,用Qiagen onestep RTPCRkit试剂(盒)进行反转录、PCR扩增,同时扩增βactin作为内参照。反应条件为:50℃逆转录30min,95℃先变性15min,然后94℃变性1min,54℃退火45s,72℃延伸1min,持续30个循环,最后72℃总延伸10min。之后将PCR产物2μL置20g/L琼脂糖凝胶(含0.5mg/L溴乙锭)电泳,对电泳带用VILBER LOURMAT凝胶成像系统进行拍摄,软件分析,以MMP9目的条带与βactin条带灰度值比值代表各产物的相对表达量。
统计学处理:采用SPSS统计软件包（statistical package for the social science）分析采用t检验。
2结果
2.1 RTPCR结果 溃疡组与对照组扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果均可见MMP9的特异条带。但病例组的MMP9的表达比对照组的MMP9的表达明显增强。电泳条带灰度比值（对照组0.67±0.02；溃疡组1.66±0.17）(表1)，采用SPSS统计软件包分析应用t检验, P<0.05,表明两者差异具有统计意义。
2.2免疫组化结果 正常人角膜中MMP9呈极弱阳性表达主要在上皮层。真菌性角膜溃疡标本中, MMP9阳性染色部位主要位于上皮层和基底膜以及角膜的基质层，表达呈强阳性。
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