作者：张兴儒
作者单位：（200062）中国上海市，上海中医药大学附属普陀医院眼科，中心实验室
【摘要】 目的：探讨硫酸镍损伤后人晶状体上皮细胞（lens epithelial cell,LECs）中热休克蛋白27（heat shock protein 27,HSP27）表达情况，并给予芪归解毒汤干预，观察晶状体上皮细胞HSP27表达的变化。
方法：体外培养正常人晶状体上皮细胞分为正常组，硫酸镍组和中药组，分别作用24h后，逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测晶状体上皮细胞HSP27 mRNA的表达水平。
结果：硫酸镍损伤可造成晶状体上皮细胞HSP27 mRNA表达水平上调(P<0.05)，预先的中药干预能使HSP27 mRNA表达水平上调(P<0.05)。
结论：硫酸镍损伤后晶状体上皮细胞HSP27 mRNA表达水平上调，给予预先的中药干预可能通过提高HSP27的表达水平从而保护晶状体上皮细胞。
【关键词】 热休克蛋白质 晶状体上皮细胞 白内障 逆转录聚合酶链反应
0引言
热休克反应是一种机体应对损伤的快速、短暂、保守的细胞应激反应过程[1]，在自然界，动物和植物细胞通过产生热休克蛋白（heat shock protein,HSP）对抗应激[2]。Bagchi等[3,4]发现在体外培养的小鼠晶状体上皮细胞受到氧化、高渗刺激后HSP70表达增高，姚克等[5]实验证实钝挫性眼外伤可造成晶状体上皮细胞的HSP27表达增高，但镍及其化合物是否能够造成晶状体上皮细胞的HSP表达增高，尚未见相关报道。镍与白内障密切相关，对镍矿区员工的调查研究发现，镍矿区工作人员白内障的发病率远高于非接触人群，白内障晶状体中镍含量明显高于正常透明晶状体[6，7]，硫酸镍对人眼晶状体上皮细胞的增殖具有明显的抑制作用，呈明显的剂量效应关系，并能诱导晶状体上皮细胞凋亡[8]。我们研究硫酸镍损伤后晶状体上皮细胞（lens epithelial cell, LEC）HSP27的表达情况以及给予中药芪归解毒汤药物血清后对LEC HSP27表达的影响。
1材料和方法
1.1材料 芪归解毒汤（黄芪、当归、土茯苓、连翘、郁金、丹参、菊花、枸杞子）由上海中医药大学附属普陀医院中药房提供，水煎，浓缩为含生药4kg/L，4℃冰箱保存备用；硫酸镍。SD大鼠，雄性，体质量180±20g，由上海中医药大学附属普陀医院实验动物中心提供。正常人永生化晶状体上皮细胞株(细胞编号：SRA01/04，上海肯强生物工程公司)，本实验室传代培养。二氧化碳培养箱（日本Sanyo公司）；倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；低温冰箱（日本Sanyo公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；Onetube Expand RTPCR system(瑞士Roche公司)；PCR仪（美国PE公司）；DNR凝胶成像系统（以色列DR公司）。
1.2方法
1.2.1人眼晶状体上皮细胞培养 LEC冻存于液氮中，用时复苏。培养液为DMEM低糖培养基，含100mL/L胎牛血清，100kU/L青霉素、链霉素，用NaHCO3调至pH=7.4。在37℃、50mL/L CO2培养箱中进行培养。将体外培养的人LECs分为3组：（1）正常对照组：正常人晶状体上皮细胞+DMEM低糖培养液；（2）硫酸镍组：正常人晶状体上皮细胞+空白对照组培养液+硫酸镍（终浓度162.71mg/L）；（3）中药组：正常人晶状体上皮细胞+硫酸镍组培养液+200g/L芪归解毒汤药物血清6mL。芪归解毒汤药物血清的制备 SD大鼠24只。每笼6只，饲养温度23±1℃，湿度40%～70%。适应性饲养1wk后，大鼠根据质量随机分为2组：正常组和给药组。根据“人和动物之间按体表面积折算的等效剂量比值表”计算出大鼠等效剂量（相当于70kg成人用量），按照10mL/kg给大鼠灌喂，正常对照组给予等量生理盐水。2次/d，连续灌喂3d。末次灌胃后1h，腹主动脉采血，3000r/min离心15min后，分离血清（切忌取到血细胞），血清呈透明、清亮、淡黄色、无沉淀、未溶血，经56℃，30min灭活处理后，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，20℃保存备用，1mo内使用。
1.2.2晶状体上皮细胞HSP27 mRNA表达的检测 采用Trizol试剂抽提各实验组细胞的总RNA。取少量总RNA用紫外分光光度仪测A260/A280，利用A260计算RNA浓度，并稀释至0.5g/L，逆转录获得的cDNA为模板，PCR扩增目的片段。20μL逆转录反应体系中含：5倍逆转录缓冲液4μL，10mmol/L dNTP 2μL，MMLV逆转录酶200U，RNA 3μg，Oligo（dt）18 2μL，RNAfree水补至20μL。25μL PCR体系中含：10倍的缓冲液2.5μL，Mg2＋2mmol/L,2.5mmol/L dNTP 2μL, 10mmol/L上下游引物各0.5μL（表1）。扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，72℃延伸10min，4℃保存产物。取20μL PCR产物进行12g/L琼脂糖凝胶电泳，以DNR凝胶成像系统分析凝胶电泳图，Biorad Qnoutity One软件进行灰度分析，重复4次。
统计学处理：运用SPSS 15.0软件包进行分析，数据以±s表示，组间均数的总体差异用方差分析，组间比较用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
培养的正常人LEC中 HSP27 mRNA表达水平较低，硫酸镍损伤24h后表达增高，中药干预后HSP27表达进一步增高（图1，2）。中药组HSP27 mRNA表达转录强度均较硫酸镍组高，差异有统计学意义（P<0.05）。
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